[发明专利]用于制备核酸的等温方法及相关组合物

说明书

根据本发明的一些方面，提供了用于核酸测序的制备方法及相关组合物。在一些实施方案中，本文的方法提供了在等温条件下模板核酸的快速扩增，以产生可直接用于标准下一代核酸测序系统的样品，所述测序系统包括：例如，基于高通量流动池的测序系统。在一些实施方案中，本发明的一些方面涉及用于制备核酸的方法，所述方法涉及在等温条件下指数扩增核酸，以用于测序。

背景技术

下一代测序技术近来的进步已经导致研究和临床环境中测序及制备方法的快速增加。高通量能力及高涵盖深度使下一代测序成为分子诊断中有吸引力且有前景的方向。作为全基因组测序的替代，可以探寻(interrogate)基因的特定子集并可以将多个样品合并(例如，多重地)入单个测序运行(例如，流动池泳道(flow cell lane))，因此减低了分析的整体成本。目前的方法仍然限速，并且对改善的方法有所需求。

发明内容

本发明的一些方面涉及这样的认识，即用于制备用于测序的核酸的现存方法既是劳动密集的，又经常需要大量的起始材料。还已经认识到，现存方法涉及的步骤(例如连接步骤、末端修复以及多腺苷酸加尾)既冗长又低效，使得这些方法无法用于获取快速且精确的测序结果，而这是分子诊断背景中所需的。在一些实施方案中，本文的方法提供了在等温条件下快速扩增模板核酸，以产生可直接用于标准下一代核酸测序系统的样品，所述系统包括例如高通量基于流动池的测序系统。在一些实施方案中，本发明的一些方面涉及用于制备核酸的方法，该方法包括在等温条件下指数扩增核酸以用于测序。因此，在一些实施方案中，本文所提供的方法是有优势的，因为其利用了等温反应条件，规避了对专门的温度循环机器的需求。在一些实施方案中，本文所提供的方法是有优势的，因为可以使用RNA和/或DNA作为起始材料利用所述方法。因此，在一些实施方案中，可以使用提取自多种不同类型的样品(例如，血液以及其他组织样品，包括获取自病理学分析的样品)的核酸利用所述方法，从而使得能够对通常组织样品进行平行诊断测试。

在一些实施方案中，已经认识到传统的制备方法经常不仅依赖于温度循环(例如，如用PCR)，而且依赖于不变的、已知的序列，以设计靶区域侧翼的扩增引物。在一些实施方案中，这限制了使用现存方法所捕获到的遗传事件的类型，使得检测由超突变、基因重排或者与未知遗传伴侣融合所导致的核酸变体成为挑战。因此，在一些实施方案中，本文所提供的方法可用于制备用于以检测大范围基因变体、重排或多态性为目的之测序的核酸。例如，在一些实施方案中所提供的方法对于扩增核酸模板是有优势的，所述核酸模板包含与未知序列融合的已知靶序列，以达到鉴定未知序列的目的。因此，在一些实施方案中，本文所提供的方法可用于制备由基因重排导致的核酸融合。在一些实施方案中，所述融合为已进行了染色体重排的基因中所编码的mRNA融合。在一些实施方案中，所述融合为含有由于染色体重排而已经融合在一起的两个基因座的染色体区段。因此，在一些实施方案中，本文所提供的制备方法可用于以对核酸进行测序为目的而扩增核酸库以检测基因组重排或融合。在一些实施方案中，本文所提供的方法可以用于检测基因组重排或融合，该方法使用测序作为标准病理学测定(例如，荧光原位杂交测定)的补充诊断测试。在一些实施方案中，本文所提供的制备方法可用于新式基因组装(例如鸟枪法测序)。在这样的实施方案中，具有杂交序列的寡核苷酸可以用于扩增含有基因组组装片段之间(例如，重叠群之间)连接的核酸。因此，在一些实施方案中，制备方法可以用于通过扩增含有基因组组装片段之间连接的核酸来确认基因组组装预期的正确性，从而确定该片段任一侧的实际序列，并确认该实际序列是否符合基因组组装预期。