[发明专利]测序方法

权利要求书

1.用于生成至少一个个体靶模板核酸分子的序列的方法，包括：

a）提供包含至少两个靶模板核酸分子的核酸分子的至少一个样品；

b）将第一分子标记引入所述至少两个靶模板核酸分子中的每一个的一端，并将第二分子标记引入所述至少两个靶模板核酸分子中的每一个的另一端，以提供至少两个带标记模板核酸分子，其中每个带标记模板核酸分子是以独有的第一分子标记和独有的第二分子标记进行标记的，且每个第一分子标记和每个第二分子标记具有与每个其他标记不同的序列；

c）扩增所述至少两个带标记模板核酸分子，以提供所述至少两个带标记模板核酸分子的多个拷贝；

d）对所述至少两个带标记模板核酸分子的包括所述第一分子标记和第二分子标记的区域进行测序；和

e）为所述至少两个靶模板核酸分子中的至少一个重建共有序列，

其中步骤e）包括

（i）通过将包含彼此相同的第一分子标记序列和彼此相同的第二分子标记序列的序列归类至同一簇，识别所述至少两个带标记模板核酸分子的多个拷贝中可能与相同靶模板核酸分子对应的区域的序列簇；

（ii）选择至少一个序列簇，其中所选择的簇内的序列包含比与其他第一分子标记或第二分子标记共有度更高地彼此关联的第一分子标记和第二分子标记；

（iii）通过对步骤（ii）中所选择的簇内的至少两个模板核酸分子的序列进行比对，并且定义这些序列的共有序列，来重建第一靶模板核酸分子的共有序列；和

（iv）对于第二模板核酸分子和/或更多的模板核酸分子，执行步骤（ii）至（iii）。

2.用于生成长度大于1Kbp的至少一个个体靶模板核酸分子的序列的方法，包括：

a）提供包含长度大于1Kbp的至少两个靶模板核酸分子的核酸分子的至少一个样品；

b）将第一分子标记引入所述至少两个靶模板核酸分子中的每一个的一端，并将第二分子标记引入所述至少两个靶模板核酸分子中的每一个的另一端，以提供至少两个带标记模板核酸分子，其中所述至少两个带标记模板核酸分子中的每一个是以独有的第一分子标记和独有的第二分子标记进行标记的，且每个第一分子标记和每个第二分子标记具有与每个其他标记不同的序列；

c）扩增所述至少两个带标记模板核酸分子，以提供所述至少两个带标记模板核酸分子的多个拷贝；

d）分离所述至少两个带标记模板核酸分子的多个拷贝的一部分，并令所述部分中的所述带标记模板核酸分子片段化以提供多个片段化的模板核酸分子；

e）对所述至少两个带标记模板核酸分子的多个拷贝中包括所述第一分子标记和第二分子标记的区域进行测序;

f）对所述多个片段化的模板核酸分子进行测序；和

g）从包含步骤f）中产生的序列的至少一个子集的序列，为所述至少两个靶模板核酸分子中的至少一个重建共有序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，（A）所述方法还包括富集多个片段化的模板分子，以增加包含所述第一分子标记或所述第二分子标记的所述多个片段化的模板核酸分子的比例的步骤，且该步骤在步骤f）之前；和/或

（B）步骤g）包括：

（i）通过将包含彼此相同的第一分子标记序列和彼此相同的第二分子标记序列的序列归类至同一簇，识别所述至少两个带标记模板核酸分子的多个拷贝中可能与相同的个体靶模板核酸分子对应的区域的序列簇；

（ii）分析所述多个片段化的模板核酸分子的序列，以识别包含与第一簇的序列的所述第一分子标记相同的第一分子标记和包含与所述第一簇的序列的所述第二分子标记相同的第二分子标记的所述多个片段化的模板核酸分子的序列；

（iii）通过比对包含步骤（ii）中识别的所述多个片段化的模板核酸分子的序列的至少一个子集的序列，并且从这些序列定义共有序列，来重建第一模板核酸分子的序列；和

（iv）对于第二模板核酸分子和/或更多的模板核酸分子，执行步骤（i）至（iii）；和/或

（C）步骤g）是由计算机实施的方法步骤；和/或

（D）步骤e）和/或f）使用包括桥式PCR步骤的测序技术进行；和/或

（E）步骤e）和f）在不同的测序运行中进行。