[发明专利]新型去除未分化干细胞和纯化精制心肌细胞的培养基

说明书

本发明的课题是找到能够更完全地对非心肌细胞或者未分化干细胞诱导细胞死亡、且能够仅挑选心肌细胞的新的条件。为了解决这样的课题，在本申请中提供用于诱导未分化干细胞的细胞死亡的细胞培养液，其为氨基酸组成中不含谷氨酰胺的物质，并且还提供通过在该细胞培养液中进行培养，从而对非心肌细胞诱导细胞死亡的方法。本申请中进而提供用于选择性地挑选心肌细胞的细胞培养液，其为添加乳酸、丙酮酸或脂肪酸、不含糖类且氨基酸组成中不含谷氨酰胺的物质，并且还提供通过在该细胞培养液中培养心肌细胞与非心肌细胞的混合物，从而选择性地挑选心肌细胞的方法。

技术领域

本发明涉及提供能够用于除去未分化干细胞和纯化精制心肌细胞的培养基。

背景技术

由于成人人体中的心肌细胞失去了增殖活性，因而在严重的心肌梗塞、心肌病等疾病时不得不持续一直以来依赖于心脏移植的状况。然而，近年来，对于胚胎干细胞(ESCs)、诱导多能性干细胞(iPSCs)等具有多能性的干细胞的研究得以发展，由此而能够对这些具有多能性的干细胞进行分化/诱导来制作心肌细胞，将这样进行了诱导的心肌细胞用于移植医疗。

然而，非生理的条件(即，in vitro条件(体外条件))下的心肌细胞的分化方式与生理发育相同，首先形成未分化的中胚层细胞，其中一部分经过预定(presumptive)心肌细胞(前心脏中胚层)后分化为心肌细胞，但是具有多能性的干细胞基本上可以分化为构成脏器的所有细胞，因此在技术上难以仅通过分化/诱导的操作使其仅分化为心肌细胞这一种细胞。另外，在非生理的条件(in vitro条件)下，有时难以引起对所有具有多能性的干细胞的目标分化，而在诱导后也残留一部分未分化干细胞。

由此，在体外将干细胞诱导分化为心肌细胞时，具有多能性的所有干细胞会残留使心肌细胞以外的细胞作为副产物产生、使未分化干细胞残留这样的对包括移植在内的临床应用不利的性质。特别是，残留的未分化干细胞具有增殖活性且能分化为多种细胞，因此，如果在治疗时移植至生物体内的细胞中残留有未分化干细胞，则由该未分化干细胞形成畸胎瘤的危险性极高(非专利文献1(Miura,et al.,Nature Biotech.,743-745,2009))。出于这样的原因，难以将通过诱导多能性干细胞的分化而制作的含有心肌细胞的细胞团直接移植至生物体内并用于治疗。因此，为了安全地使用源自多能性干细胞的心肌细胞进行治疗并得到理想的治疗效果，有必要找到完全排除未分化的多能性干细胞且对心肌细胞进行高度精制的方法(即，除去除了心肌细胞以外的细胞的方法)。

迄今为止，已经报告了在培养条件中选择性地除去未分化干细胞的方法(非专利文献2(Ben-David,et al.,Cell Stem Cell,2013 12,pp.167-179)、非专利文献3(Wang,etal.,Science,325,435-439,2009))、非专利文献4(Shiraki,et al.,Cell Metabolism,2014,19,1-15)。在非专利文献2中，发现油酸对于人的未分化多能性干细胞的维持是重要的，证实了：可以通过相反地利用该条件，抑制在人的未分化多能性干细胞内的油酸的生物合成，从而选择性地除去人的未分化多能性干细胞。另外，在非专利文献3中，证实了即使小鼠的胚胎干细胞(胚胎干细胞)能够在排除了除了苏氨酸以外的其它氨基酸的培养液中形成集落，但也无法在排除了苏氨酸的培养液中形成集落，并且证实了通过在除去了苏氨酸的培养液中进行培养，从而能够选择性地除去小鼠的未分化胚胎干细胞。在非专利文献4中，证实了：对于人多能性干细胞，蛋氨酸起到小鼠胚胎干细胞中的苏氨酸的作用，在除去了蛋氨酸的培养液中未分化干细胞死亡或者分化，因此能够选择性地除去人未分化干细胞。

然而，在这些文献已证实的方法中，虽然能够除去未分化多能性干细胞，但是却不能除去已经诱导了的除了心肌细胞以外的分化的非心肌细胞。进而，在非专利文献3和非专利文献4中，由于在合成蛋白时除去了非常重要的必需氨基酸，因此也担心对残存的目标细胞的影响。