[发明专利]蛋白质的改良高分泌生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及在酵母中的蛋白质的高分泌生产方法。

背景技术

治疗用蛋白质、抗体药物等蛋白质性医药品由于基因重组技术的发展而急速地扩展市场，作为使这些蛋白质性医药品生产的宿主使用了CHO、NS0等动物细胞；蚕等昆虫或SF9等昆虫细胞；大肠杆菌、酵母等微生物等。其中，酵母能够高密度培养，因此被广泛用作在比较廉价的培养基中可以分泌生产有用蛋白质的体系。

然而，当分泌蛋白质的存在于N末端的信号序列氨基酸区域被信号识别颗粒(SRP：signal recognition particle)识别时，该分泌蛋白质通过易位子而进入内质网，当该分泌蛋白质通过易位子时其高级结构被解开，并在内质网内进行折叠(folding)。该分泌蛋白质的折叠能够自然地发生，但各种的分子伴侣协助折叠。在内质网内所形成的天然的立体结构的形成对于分泌是重要的，错折叠的蛋白质无法进入位于下游的分泌途径，使高级结构异常的蛋白质蓄积。这种在内质网内引起的修饰(糖链、二硫键的添加)的障碍，成为从内质网的输送降低的原因，引起被称为“内质网应激”的状态。作为对应于该内质网应激的手段，真核生物的细胞诱导被称为“解折叠蛋白应答(Unfolded Protein Response, UPR)”的应激反应。UPR中的转录诱导、翻译调节是要对已蓄积的异常蛋白质进行修复的反应，但也是分解、排除异常蛋白质以维持内质网内的恒定性(恒定)的所谓内质网相关降解(ERAD：ER-associated degradation)的机制。另外，已知分子伴侣不仅有助于内质网内的蛋白质折叠，而且可以将已凝集的蛋白质解开(解链)以用于折叠。例如，HSP104与HSP70协同可以进行从凝集体可溶化蛋白质的其它伴侣不可能的反应(非专利文献1)。

另一方面，在观察蛋白质的立体结构内部时，氢键、静电相互作用、疏水性相互作用等多数相互作用在氨基酸之间发挥作用。其中，被称为二硫键的两个半胱氨酸通过接受双电子氧化而形成的硫原子之间的共价键，由于其坚固的性质在使蛋白质的立体结构稳定化方面变得非常重要。实际上，分泌到细胞外的多数分泌蛋白质具有二硫键，这推定：与膜所包围的细胞内部相比，在作为物理性、化学性更严酷的环境的细胞外发挥作用时，需要使蛋白质的结构更牢固。在酵母等真核细胞中，基于蛋白质的氧化性折叠的二硫键的导入，在内质网内通过氧化型PDI (蛋白质二硫键异构酶，Protein disulfide isomerase)来进行(非专利文献2)。将成为底物的蛋白质氧化而形成的还原型的PDI，通过局部存在于膜附近的氧化型ERO1进行再氧化(非专利文献3、4)。在酵母的内质网中，存在5种类(PDI1、EUG1、MPD1、MPD2、EPS1)的PDI家族(非专利文献5)。在这些PDI家族之中，确认到与ERO1形成分子间二硫键的是PDI1和MPD2。另外还报道了：在蛋白质的氧化性折叠中，通过将BiP/Kar2与PDI协同来提高效率(非专利文献6)。BiP/Kar2还参与与上述UPR相关的基于各种基因的活性型HAC1的诱导。活性型HAC1通过作为跨膜激酶/核酸酶(kinase/nucleas)的IRE1而使HAC1剪接，从而被活化。关于BiP/Kar2所结合的IRE1，当BiP/Kar2作用于内质网内的具有异常结构的蛋白质时发生解离，通过形成2聚体而显示核酸酶活性，将HAC1剪接而生成活性型HAC1 (非专利文献7、8)。另外，Bip/Kar2与存在于内质网的SCJ1协同，也参与在内质网内的蛋白质的折叠(非专利文献9)。

如上所述，已经明确了各种的分子伴侣参与分泌蛋白质的正确折叠，报道了：通过在酵母中使编码上述PDI1、ERO1和Kar2等分子伴侣蛋白的基因的1种或2种以上与作为表达对象的目标蛋白质基因共表达，以使具有复杂的立体结构的目标蛋白质的分泌生产性提高(专利文献1)。