[发明专利]从血液特异性靶向捕获人类基因组和转录组区域的方法

权利要求书

1.一种用于产生核酸分子的串联线性拷贝的方法，所述方法包括：

提供不同环状嵌合单链核酸构建体的集合，每个构建体包含：

来自宿主生物体的原始基因组DNA的第一单链区段；和

连接至所述第一单链区段且包含对所述宿主生物体而言为外源性的核苷酸序列的第二单链合成核酸区段，所述核苷酸序列包含独特标识符部分，其中所述独特标识符部分和所述原始基因组DNA的区段的核苷酸序列区分所述集合的一个嵌合单链核酸构建体与所述集合的所有其它嵌合单链核酸构建体；

将所述不同环状嵌合单链核酸构建体的集合与具有链置换活性的聚合酶和一个或多个初级引物掺混，其中所述一个或多个初级引物与所述集合的一个或多个环状嵌合单链核酸构建体的一部分互补，借此所述掺混形成滚环延伸混合物；

使所述滚环延伸混合物经受一种或多种杂交和延伸处理，其中所述一个或多个初级引物与所述环状嵌合单链核酸构建体杂交且所述聚合酶延伸杂交的初级引物以产生单链延伸产物，每个单链延伸产物包含两条或更多条串联线性序列，其中每个串联线性序列与来自所述集合的嵌合单链核酸构建体互补；

使所述具有链置换活性的聚合酶失活；

提供一个或多个次级引物组，每个次级引物组包含(a)包含与从所述一个或多个初级引物形成的单链延伸产物的第一部分互补的核苷酸序列的第一次级引物，和(b)包含与单链延伸产物的第二部分互补的核苷酸序列的第二次级引物，所述第二部分不同于从所述一个或多个初级引物形成的所述单链延伸产物的第一部分且从所述第一部分移位；

提供在所述单链延伸产物和第一次级引物彼此杂交时裂解所述单链延伸产物和第一次级引物的核酸内切酶；

将所述单链延伸产物与缺乏链置换活性的聚合酶、连接酶、所述核酸内切酶和所述一个或多个次级引物组掺混，以形成延伸-连接-裂解反应混合物；

使所述延伸-连接-裂解反应混合物经受杂交和延伸处理，其中所述第一和第二次级引物与所述单链延伸产物杂交，所述聚合酶延伸杂交的次级引物，所述连接酶连接所述延伸的杂交次级引物以形成双链延伸产物，且所述核酸内切酶在所述第一次级引物与所述单链延伸产物杂交的位置处裂解所述双链延伸产物以产生双链延伸产物片段，其中所述双链延伸产物片段包含与来自所述集合的嵌合单链核酸构建体互补的两条或更多条串联线性序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述双链延伸产物片段中的串联线性序列的数目是由所述延伸-连接-裂解反应混合物中的第一和第二次级引物的比率确定。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述滚环延伸混合物进一步包含：

甲基敏感性限制性核酸内切酶，其中在所述使所述滚环延伸混合物经受所述一种或多种杂交和延伸处理期间，如果识别序列是未甲基化的，则所述核酸内切酶在所述识别序列处裂解双链DNA，从而只从包含原始甲基化基因组DNA的第一单链区段的嵌合单链核酸构建体选择性地形成单链延伸产物。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其进一步包括：

对所述双链延伸产物片段测序。

5.根据权利要求4所述的方法，其中在所述测序前将通用接头序列附接至所述双链延伸产物片段的5′和3′端。

6.根据权利要求4所述的方法，其中使用选自由以下所组成的组的方法进行所述测序：荧光引物杂交、分子信标杂交、引物延伸、基于核酸外切酶的测序、连接酶检测反应、连接酶链反应、焦磷酸测序、基于荧光的边合成边测序、基于荧光的边连接边测序、基于纳米孔的测序、基于离子的边合成边测序和基于离子的边连接边测序。