[发明专利]不耐热性核酸外切酶

说明书

本发明提供了核酸外切酶或其酶促活性片段，所述核酸外切酶具有SEQ ID No.1的氨基酸序列或与其至少约50％相同的氨基酸序列，其中所述核酸外切酶或其酶促活性片段(i)通过在由10mM Tris‑HCl，在25℃下pH 8.5，50mM KCl和5mM MgCl₂组成的缓冲液中在约55℃的温度下加热10分钟而基本上不可逆地失活；(ii)对于单链DNA基本上特异性；和(iii)具有3’‑5’核酸外切酶活性。本发明还提供了其中使用核酸外切酶或其酶促活性片段的从样品中去除单链DNA的方法，核酸扩增方法，逆转录方法和核酸序列分析方法。本发明还进一步提供了编码所述核酸外切酶或其酶促活性片段的核酸以及包含其的试剂盒或组合物。

技术领域

本发明涉及不耐热性核酸外切酶及其从含有生物分子的样品中去除单链DNA的用途，所述生物分子特别是核酸扩增或逆转录反应的产物(例如双链DNA、RNA和DNA:RNA双链体)。本发明因此可特别视为涉及通过去除单链DNA来提纯含有双链DNA、RNA和/或DNA:RNA双链体的样品。更具体地，本发明涉及从核酸扩增或逆转录反应的产物中去除过量寡脱氧核糖核苷酸引物。从核酸扩增反应的产物中去除过量寡脱氧核糖核苷酸引物可增强这种产物的下游序列分析，因为降低了来自过量寡脱氧核糖核苷酸引物的干扰。本发明因此还涉及用于最佳化核酸扩增或逆转录反应产物的序列分析(例如通过核酸测序或寡核苷酸探针阵列)的方法。本发明还提供了用于最佳化未得自核酸扩增反应的核酸的序列分析的方法。

背景技术

核酸酶是破坏DNA或RNA聚合物中的糖-磷酸盐主链中的磷酸二酯键的酶。核酸酶是非常多样化的一组酶。作用方式可以是高度特异性的或非常一般的，这取决于其靶功能。核酸酶可优选单链(ss)聚合物或双链(ds)聚合物。一些核酸酶在特定核苷酸序列处切割(例如限制性核酸内切酶)，而其他核酸酶在不依赖于核苷酸序列的聚合物中的位置处切割。在细胞中，核酸酶具有各种功能，并且涉及DNA复制、重组、突变、转录和修复以及分解RNA和DNA的冗余小片。核酸酶也可在宿主防御机制中发挥作用。

所有核酸酶可基于其催化机制涉及两个、一个还是零个金属离子分为三个主要类别(双金属离子依赖性、单金属离子依赖性和金属不依赖性核酸酶超家族)。每个类别包括许多不同的家庭和超家族。关于核酸酶分类的更多细节，参见Yang,W.,2011,Nucleases:diversity of structure,function and mechanism.Q Rev Biophys 44(1):1-93。

基于底物偏好，核酸酶可分类为脱氧核糖核酸酶(DNA酶)或核糖核酸酶(RNA酶)，即分别切割DNA或RNA的磷酸二酯键的酶。基于DNA或RNA聚合物内的切割键的位置，核酸酶还可分类为核酸内切酶或核酸外切酶。核酸内切酶在聚合物内的位置处切割DNA或RNA的磷酸二酯键，而核酸外切酶涉及修剪RNA和DNA聚合物的末端，切割链中最外面的磷酸二酯键。核酸外切酶还可通过5’至3’相对于3’至5’极性分成两组。核酸酶还可展示在单链和双链核酸之间的特异性。特定的核酸酶可以是严格单链特异性、单链优先、严格双链特异性、双链优先或切割两者的核酸酶。

许多核酸外切酶是已知的，其中大肠杆菌(Escherichia coli)酶是得到最充分表征的酶。核酸外切酶的共同特征是它们在释放单核苷酸的单一结合事件中降解高达1000个核苷酸的高持续合成能力。核酸外切酶I(ExoI)、核酸外切酶VII(ExoVII)和RecJ核酸外切酶均被报道为涉及DNA修复中的ssDNA特异性核酸外切酶。然而，它们的作用极性不同。ExoI具有3’至5’核酸外切酶活性，而RecJ仅具有5’至3’活性。与其他核酸外切酶形成对比，ExoVII具有5'至3'和3'至5'核酸外切酶活性两者。