[发明专利]利用单管添加方案的加标签的核酸的文库制备

说明书

一种制备加标签的核酸片段的文库的方法，所述方法包括：使细胞群体与具有一种或更多种蛋白酶的裂解试剂直接接触，以生成细胞裂解物；使蛋白酶失活，以生成失活的细胞裂解物，和在其中靶核酸和转座子末端成分经历转座反应的条件下，将转座酶和包含转移链的转座子末端成分应用至失活的细胞裂解物。

技术领域

本公开内容大体涉及用于制备核酸片段的文库的方法，且更特别地涉及用于在单管中利用蛋白酶制备核酸片段的文库用于多种应用包括例如下一代DNA测序的方法。

背景技术

存在这样的多种方法和应用，对于其来说，期望生成片段化并加标签的核酸的文库，例如用作DNA测序的模板和/或用于分析拷贝数变异。

最近开发的“下一代”DNA测序技术，诸如由Illumina,Inc.(San Diego,CA)开发的那些“下一代”DNA测序技术，利用大规模并行或多重格式使能够在单个序列运行中从数百万个测序模板生成序列数据。“下一代”测序的该大规模并行性质要求生成包含来自靶核酸样品例如基因组DNA的核酸片段的集合或群体的核酸片段文库。更重要地，它要求这些核酸片段的组合展现出为来自靶核酸样品的序列的定性和/或定量代表的序列。当核酸样品来自细胞时，目前的用于生成核酸片段的文库的方法通常要求分离步骤，用于在核酸片段化之前将靶核酸从细胞分离。该核酸提取步骤通常浪费靶核酸样品，并且通常致使制备的核酸不能定性地代表来自样品的靶核酸。当样品的量有限或难以获得时，这成为特别严重的问题。为了解决该问题，目前的一些方法在片段化之前使用核酸扩增。但是，扩增无法确保靶核酸的代表性，因为靶核酸在扩增之前的提取期间仍部分地丢失。

因此，对能够快速并有效地制备核酸片段文库的新方法存在需求。本公开内容通过提供用于利用蛋白酶在单个反应混合物中例如在单个管中制备核酸片段的文库的方法，解决了该需求。还提供了相关优势。

发明内容

在一个方面，本文提供了制备加标签的核酸片段的文库的方法，所述方法包括：(a)使细胞群体直接与裂解试剂接触，以生成细胞裂解物，其中裂解试剂具有一种或更多种蛋白酶，并且其中细胞裂解物包含靶核酸；(b)使一种或更多种蛋白酶失活，以形式失活的细胞裂解物，和(c)在其中靶核酸和转座子末端成分经历转座反应以生成混合体(mixture)的条件下，将至少一种转座酶和包含转移链的至少一种转座子末端成分直接应用于失活的细胞裂解物，其中(i)靶核酸被片段化以生成多个靶核酸片段，并且(ii)转座子末端成分的转移链被连接至多个靶核酸片段的每一个的5'末端，以生成多个5'加标签的靶核酸片段。

在一些实施方案中，本文提供的步骤(a)、(b)和(c)在单个反应混合物中例如在一个管中进行。在一些实施方案中，细胞群体为细胞的最小群体。在一些实施方案中，细胞的最小群体包含一个、两个、三个、四个或五个细胞。

在一些实施方案中，一种或更多种蛋白酶选自由以下组成的组：丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。在一些实施方案中，一种或更多种蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶及其变体。在一些实施方案中，一种或更多种蛋白酶在细胞裂解物中的浓度为0.1mg/ml至10mg/ml。在一些实施方案中，一种或更多种蛋白酶在细胞裂解物中的浓度为0.1mg/ml至2.5mg/ml。在一些实施方案中，一种或更多种蛋白酶在细胞裂解物中的浓度为0.5mg/ml。在一些实施方案中，一种或更多种蛋白酶在细胞裂解物中的浓度为4.5mAU/ml至500mAU/ml。在一些实施方案中，一种或更多种蛋白酶在细胞裂解物中的浓度为22.5mAU/ml。

在一些实施方案中，在步骤(a)中细胞群体在pH 7.0至pH 10.0与裂解试剂接触。在一些实施方案中，细胞群体在pH 7.0至pH 9.0与裂解试剂接触。