[发明专利]在相同的真核细胞产生宿主中发现和产生条件活性生物蛋白

权利要求书

1.一种制备条件活性生物蛋白的方法，所述方法包括：

i.选择野生型生物蛋白；

ii.使用一种或多种演变技术演变编码所述野生型生物蛋白的DNA以产生突变DNA；

iii.在真核细胞产生宿主中表达所述突变DNA以获得突变蛋白；

iv.在正常生理条件下和异常条件下对所述突变蛋白和野生型蛋白进行测试；

v.从步骤(iii)中表达的突变蛋白中选择表现出以下特性中至少一种的条件活性突变蛋白：(a)在正常生理条件下的测试中较所述野生型蛋白活性下降，以及(b)在异常条件下的测试中较所述野生型蛋白活性增强；以及

vi.在与步骤(iii)中使用的真核细胞产生宿主相同的真核细胞产生宿主中产生条件活性生物蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述条件活性生物蛋白表现出以下两种特性：(a)在正常生理条件下的测试中较所述野生型蛋白活性下降，以及(b)在异常条件下的测试中较所述野生型蛋白活性增强。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述野生型生物蛋白为抗体。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述野生型生物蛋白选自组织纤溶酶原激活物、链激酶、尿激酶、肾素和透明质酸酶。

5.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述野生型生物蛋白选自降钙素基因相关肽、P物质、神经肽Y、血管活性肠肽、血管加压素、血管抑素、与靶细胞上的靶蛋白结合的蛋白和DNA/RNA修饰蛋白。

6.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述正常生理条件选自正常生理温度、pH、渗透压、重量摩尔渗透压浓度、氧化应激和电解质浓度中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述正常生理条件为温度；并且其中所述条件活性生物蛋白在正常生理温度下基本无活性，且在低于正常生理温度的异常温度下有活性。

8.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述演变步骤包括选自PCR、易错PCR、改组、寡核苷酸定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、循环总体诱变、指数总体诱变、位点特异性诱变、基因再组装、基因位点饱和诱变、体外诱变、连接酶链反应、寡核苷酸合成及其组合的技术。

9.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述真核细胞产生宿主选自真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、腺病毒和植物细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述真菌细胞选自来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、汉逊酵母(Hansenula plymorpha)和黑曲霉(Aspergillus niger)的细胞。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述昆虫细胞选自果蝇S2细胞和夜蛾Sf9细胞。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自Bowes黑色素瘤细胞、COS-7细胞、C127细胞、HeLa细胞、BHK细胞、3T3小鼠成纤维细胞、BHK21叙利亚仓鼠成纤维细胞、MDCK狗上皮细胞、PtK1鼠袋鼠上皮细胞、SP2/0小鼠浆细胞、NS0小鼠浆细胞、HEK 293人胚胎肾细胞、COS猴肾细胞、CHO细胞、CHO-S、R1小鼠胚胎细胞、E14.1小鼠胚胎细胞、H1人胚胎细胞、H9人胚胎细胞和PER C.6人胚胎细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、NS0小鼠浆细胞和HEK293人胚胎肾细胞。

14.根据权利要3所述的方法，其还包括将条件活性抗体与选自细胞因子、白细胞介素、酶、激素、生长因子、细胞毒性物质、化疗药物、放射性颗粒和诊断剂的分子缀合的步骤。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述缀合包括在所述条件活性抗体和所述分子之间形成共价键。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述缀合包括在所述条件活性抗体和所述分子之间形成非共价键。