[发明专利]在丝状真菌中具有哺乳动物样N-聚糖的糖蛋白的制备

权利要求书

1.产生具有哺乳动物样N-聚糖的异源糖蛋白的丝状真菌细胞，包含：

i.一个或多个突变，与不具有所述突变的亲本丝状真菌细胞相比，所述一个或多个突变降低或消除一种或多种内源蛋白酶活性；

ii.编码寡糖基转移酶的异源催化亚单元的多核苷酸；

iii.任选的，增加α1,2甘露糖苷酶活性的重组多核苷酸；和

iv.编码所述异源糖蛋白的重组多核苷酸，

其中所述产生的异源糖蛋白的总中性N-聚糖的至少90％(mol％),优选至少95％来自：

·Manα3[Manα6(Manα3)Manα6)]Manβ4GlcNAβ4GlcNAc(Man5糖型)；

·GlcNAcβ2Manα3[Manα6(Manα3)Manα6)]Manβ4GlcNAβ4GlcNAc(GlcNAcMan5糖型)；

·Manα6(Manα3)Manβ4GlcNAβ4GlcNAc(Man3糖型)；

·Manα6(GlcNAcβ2Manα3)Manβ4GlcNAβ4GlcNAc(GlcNAcMan3糖型)；

·选自G0、G1或G2糖型的复合型N-聚糖；和

·复合型岩藻糖基化的N聚糖FG0、FG1或FG2糖型。

2.权利要求1所述的丝状真菌细胞，其中所述真菌细胞是木霉属真菌细胞、毁丝霉属真菌细胞、曲霉属真菌细胞、链孢霉属真菌细胞、青霉属细胞、镰刀菌属细胞、根霉属细胞、毛霉属细胞、或金孢霉属真菌细胞。

3.权利要求1或2所述的丝状真菌细胞，其中总蛋白酶活性降低至其中蛋白酶不具有降低活性的相应亲本丝状真菌细胞的总蛋白酶活性的40％或更低，优选6％或更低。

4.权利要求1-3任一项所述的丝状真菌细胞，其包含PMT基因突变，其与不具有所述突变的亲本丝状真菌细胞相比降低内源O-甘露糖基转移酶的活性。

5.权利要求1-4任一项所述的丝状真菌细胞，其缺失OCH1活性和/或EndoT活性。

6.权利要求1-5任一项所述的丝状真菌细胞，所述寡糖基转移酶的催化亚单元选自利什曼原虫的寡糖基转移酶催化亚单元。

7.前述权利要求任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述真菌细胞进一步包含编码ALG3的基因的突变，其与不具有所述突变的亲本细胞的ALG3基因的表达水平相比降低或消除相应的ALG3表达。

8.权利要求7所述的丝状真菌细胞，其包含优选选自以下的用于增加α葡萄糖苷酶II活性的重组多核苷酸：木霉α葡萄糖苷酶II编码序列、曲霉α葡萄糖苷酶II催化结构域编码序列、微藻α葡萄糖苷酶II催化结构域编码序列或锥虫α葡萄糖苷酶II催化结构域编码序列。

9.权利要求7-8任一项所述的丝状真菌细胞，其包含：

i.编码N-乙酰葡萄糖胺基转移酶I催化结构域的多核苷酸，优选选自三角褐指藻或非洲爪蟾GnTI或微藻GnTI的催化结构域编码序列，和

ii.编码N-乙酰葡萄糖胺基转移酶II催化结构域的多核苷酸。

10.权利要求1-6任一项所述的丝状真菌细胞，进一步包含分别编码以下多肽的多核苷酸：

i.N-乙酰葡萄糖胺基转移酶I催化结构域；优选选自三角褐指藻或非洲爪蟾GnTI或微藻GnTI编码序列，

ii.α甘露糖苷酶II；优选Caenorhabditis remanei或致倦库蚊的α甘露糖苷酶II催化结构域；

iii.N-乙酰葡萄糖胺基转移酶II催化结构域；和

iv.任选的，β1,4半乳糖基转移酶活性，

v.进一步任选的，岩藻糖基转移酶活性和GDP岩藻糖合成活性。

11.前述权利要求任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述异源多肽选自抗体及其抗原结合片段、生长因子、干扰素、细胞因子和白细胞介素。