[发明专利]利用热稳定性错配内切核酸酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及识别和切割双链核酸中错配的碱基对的新型耐热错配内切核酸酶，包含所述错配内切核酸酶的组合物，以及使用所述错配内切核酸酶的方法。

背景技术

近年来，突变分析方法得到显著发展。突变分析方法已用于人类的遗传诊断以及农作物的改良和有用微生物的分离或产生，因此对一般生活有极大的贡献。

许多突变分析方法包括基因组序列的直接分析。然而，存在一些突变分析方法，包括使用识别错配的碱基对的酶。突变分析方法包括用能够特异性结合由突变型DNA和野生型DNA形成的错配碱基对的因子进行检测。突变分析方法的代表性实例包括通过使用来自大肠杆菌的MutS、MutT和MutL复合物检测突变位点（专利文献1）。

包括使用特异性切割错配位点的错配内切核酸酶的突变分析方法也是已知的。在这种方法中，使用错配内切核酸酶切割错配碱基对附近的DNA，并分析如此获得的DNA片段以检测突变的存在或不存在和位置。

作为代表性的例子，已知包括使用来自芹菜的细胞基因产物的方法（专利文献2），实际上该方法用于碱基突变的分析。然而，该酶不耐热，因此不能用于涉及高温反应过程如PCR的技术。因此，为了检测碱基突变，该方法需要扩增、错配形成、错配切割和检测的四个步骤。

近年来，已经开发了耐热错配核酸内切酶，并且已经预期它们的用途。错配内切核酸酶的特征在于识别G-G、G-T、T-G和T-T错配位点，并在错配附近切割DNA的两条链（专利文献3）。

除了突变分析，具有很大影响的生物技术的实例包括核酸扩增技术。

核酸扩增技术的代表性实例是聚合酶链反应（PCR）。PCR是用于在体外容易地扩增期望的核酸片段的技术。PCR是一种实验技术，其在包括生物学、医学和农业领域的广泛领域以及关于基因的研究中是必需的。PCR也适用于突变基因的检测和DNA甲基化的分析。

等温核酸扩增法如LAMP法和ICAN法不需要特殊的设备，因此，它们被用作检测核酸的较便宜的方法。

对于近年来进行的全基因组的结构分析，全基因组扩增方法是一种重要的技术，特别是对于稀少样品的分析。

在这些核酸扩增方法中，不正确碱基的掺入以恒定的概率发生。通过改进DNA聚合酶等已经降低了概率。然而，不正确碱基的掺入仍干扰精确分析。

在构建基因组文库或cDNA文库时，核酸扩增方法优先扩增具有较高含量的DNA分子，这可能干扰各种DNA的分析或筛选。

为了解决上述问题，通过利用自杂交的正常化来降低具有较高含量的DNA的比例（非专利文献1）。还使用其中组合了PCR和自杂交的SSH-PCR（非专利文献2）。然而，使用这些方法，也可以除去与具有较高含量的DNA同源的DNA。

在通过核酸扩增法检测DNA时，靶DNA和非靶DNA可能竞争扩增。换句话说，当非靶DNA随着靶DNA扩增而同时扩增时，难以检测靶DNA。上述问题可以通过使用其中使用诸如循环探针或TaqMan探针的探针仅检测靶DNA的实时PCR来解决。然而，在非靶DNA相对于靶DNA以过高的量存在的情况下，由于与许多相似DNA的假阳性反应，难以精确地检测靶DNA。

这种问题可能在存在正常等位基因的情况下检测少量突变等位基因（例如，检测循环肿瘤DNA），通过表观遗传学测定检测少量甲基化或非甲基化等位基因，检测在母亲的血液中循环的少量胎儿DNA序列等时发生。

为了解决上述问题，已经开发了称为限制性内切核酸酶介导的选择性聚合酶链式反应（REMS PCR）的方法（非专利文献3）。该方法包括使用耐热限制酶。在该方法中，使用引物选择性检测具有突变核苷酸序列的DNA，所述引物例如设计为使得仅当模板具有正常核苷酸序列时才发生限制酶的切割。然而，根据待检测的靶DNA，可能没有具有适合于通过REMS PCR的选择性检测的识别序列的耐热限制酶。因此，REMS PCR缺乏通用性。

如上所述，对于涉及核酸扩增的突变检测方法，需要一种即使当非靶DNA相对于靶DNA以过高的量存在时避免与许多相似DNA的假阳性反应的方法。

引文列表

专利文献

专利文献1: US 5922539 B

专利文献2: WO 01/062974

专利文献3: WO 2014/142261

非专利文献