[发明专利]用于造血干细胞中核酸酶介导的基因组工程化和校正的方法和组合物

说明书

本公开是在基因组工程领域内，特别是造血干细胞的基因组的靶向修饰。本文公开用于改变表达或用于校正一种或多种编码在遗传性疾病(例如镰状细胞疾病)中所涉及的蛋白的基因(例如，产生疾病中的缺乏、不足或异常的蛋白和/或调节这些蛋白的蛋白)的方法和组合物。本发明描述了用于基因治疗和基因组工程中的组合物和方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年9月16日提交的美国临时申请No.62/051,159的权益，所述临时申请的公开内容在此通过引用全文并入。

技术领域

本公开属于造血干细胞的基因组工程领域，特别是造血细胞的基因组的靶向修饰。

背景技术

在用于大量疾病的基因治疗中最有希望的方法之一涉及使用干细胞的体外遗传修饰，然后移植并在患者体内植入经修饰的细胞。当引入的干细胞显示长期持久性和多谱系分化时是特别有希望的。造血干细胞(最常见的是基于CD34细胞表面标记物的表达的富集的细胞形式)是最特别有用的细胞群，因为它们可以容易获得并含有长期造血干细胞(LT-HSC)，其可以在移植后重建整个造血谱系。

已经描述了用于基因组DNA的靶向裂解(cleavage)的各种方法和组合物。这种靶向裂解事件可用于例如诱导靶向诱变，诱导细胞DNA序列的靶向缺失，并促进来自任何生物体的细胞中预定染色体基因座处的靶向重组。参见，例如，美国专利No.9,045,763；美国专利No.9,005,973；美国专利No.8,956,828；美国专利No.8,945,868；美国专利No.8,586,526；美国专利No.6,534,261；美国专利No.6,599,692；美国专利No.6,503,717；美国专利No.6,689,558；美国专利No.7,067,317；美国专利No.7,262,054；美国专利No.7,888,121；美国专利No.7,972,854；美国专利No.7,914,796；美国专利No.7,951,925；美国专利No.8,110,379；美国专利No.8,409,861；美国专利公布20030232410；美国专利公布20050208489；美国专利公布20050026157；美国专利公布20050064474；美国专利公布20060063231；美国专利公布20080159996；美国专利公布201000218264；美国专利公布20120017290；美国专利公布20110265198；美国专利公布20130137104；美国专利公布20130122591；美国专利公布20130177983与美国专利公布20130177960和美国专利公布20150056705以及美国申请No.14/706,747，其公开内容通过引用整体并入本文以用于所有目的。这些方法通常涉及使用工程改造裂解系统来诱导靶DNA序列中的双链断裂(DSB)或切口，使得通过错误产生过程导致的断裂的修复(如非同源末端连接(NHEJ))或使用修复模板的修复(同源性定向修复或HDR)可以导致基因的敲除或目的序列的插入(靶向整合)。随后的修复途径(NHEJ与HDR或两者)通常取决于修复模板的存在和几种竞争性修复途径的活性。

在不存在外部供应的修复模板(例如供体)的情况下引入的双链断裂通常用于经由通过细胞NHEJ途径引入的突变使靶基因失活。NHEJ途径可以基于微观同源介导的末端连接而分离成标准Ku依赖性途径和替代的Ku独立途径，该微观同源介导的末端连接利用了在裂解位点附近的直接重复的短轨道。通过这两个NHEJ途径进行基因编辑后的插入和/或缺失(“indel”)模式不同，这可能导致突变的功能结果方面的差异，具体取决于应用。

在携带与双链断裂的旁侧序列同源的段(stretch)的外部供应的供体的存在下，使用供体分子的同源性定向基因修复(HDR)可以用于改变单碱基或小段的序列(“基因校正”)，或者在另一方面，用于将整个表达盒(“基因添加”)靶向插入预定的基因组位置。