[发明专利]通过用于植入的离体成骨细胞培养诱导骨形成的方法

说明书

发明领域：

本发明涉及诱导骨形成的方法，特别是通过成骨细胞植入诱导骨形成的方法。

发明背景：

已知成骨细胞是控制骨形成的合成和矿化及其随后的重塑的大细胞。由成骨细胞形成骨的过程被称为骨生成，其包括3个基本步骤：(a)细胞外有机基质(类骨质)的合成；(b)导致骨形成的基质矿化；(c)通过再吸收和再形成过程的骨重塑。骨重塑是连续的合成和破坏过程，其赋予骨其成熟结构并维持骨的正常结构。目前，骨的破坏或再吸收借助于被称为破骨细胞的大细胞发生。

在骨相关病症中或在归因于断裂或损伤的新骨形成的情况期间，用于替代缺损骨的常规方法有很多。根据情况，某些情形可以证明有挑战性，尤其是骨的重新排列。

可利用多种类型的自体骨移植，其提供良好的机械性能和生物学性能，但例如供区并发症、塑型挑战、收集移植物的操作时间有限和可用量体积有限的因素是巨大的顾虑。

此外，涉及组织移植的同种异体移植是其中供体具有不同遗传组成的一种。虽然同种异体移植由于没有供区并发症且没有量限制从而减轻了与自体骨移植相关的一些问题，但其涉及少数其它问题，所述问题可以是减弱归因于不同遗传组成的骨排斥反应的消毒过程或者移植物可传播感染(例如肝炎和HIV/AIDS)。

借助于生长因子例如BMP(骨形态发生蛋白)的骨生成是另一种方法，其中缺损骨的定量替换对于提供可预测的结果而言相当少。

因此，需要减轻与替换缺损骨的现有方法相关的上述问题。

发明目标：

1.本发明的一个目标是使用成骨细胞诱导骨形成。

2.本发明的另一个目标是提供模拟天然骨形成的方法，与已经存在的方法相比，其提供高度加速的方法。

3.本发明的另一个目标是提供与以前已知的方法不同的微创方法和省时方法。

4.本发明的另一个目标是预防供区并发症并为骨形成提供相当大量的成骨细胞。

发明概述：

本发明解决了与诱导骨形成的方法相关的现有问题，并提供了包括离体成骨细胞培养的植入方法。此外，离体培养可被定义为在外部环境中培养而不改变天然条件和参数。离体培养导致形成待注射在骨形成部位的活性物质，其还包括以下步骤：分离骨祖细胞，使骨祖细胞分化为成骨细胞，扩增培养，收集细胞培养物，洗涤和填充以及包装。本发明除了是微创方法之外，还特别加速了骨形成过程。

发明详述：

本发明涉及在有此需要的病症或缺损区域中通过成骨细胞植入诱导骨形成的方法。

本发明的方法是成骨细胞植入方法，其以该方法包括用于诱导骨形成的步骤的方式被广泛构建。

因此，成骨细胞植入所涉及的广泛步骤是活成骨细胞的离体培养。此外，在下面的说明中详细描述了所述步骤：

离体培养是在从受试者收集骨髓细胞之后进行的。顾名思义，收集包括从受试者的后上髂嵴或胸骨收集骨髓。此外，此处的受试者是诱导的骨形成的接受者。

为了进行离体培养，需要将活检试剂盒运出进行收集的地方。活检试剂盒在装运之前进行预处理，然后在运输期间在2-8℃范围内的严格温度监控下运输。另外，必须确保收集的骨髓无菌转移到无菌活检收集介质中。

离体成骨细胞培养涉及活性物质的形成。活性物质可被定义为注射在诱导骨形成部位的物质。导致活性物质形成的方法还包括以下步骤：

分离骨祖细胞，使骨祖细胞分化为成骨细胞，扩增培养，收集细胞培养物，洗涤和填充。

如上所述，离体培养从分离骨祖细胞开始。骨祖细胞是间充质细胞，其分化为成骨细胞，在该过程中胶原被分泌以硬化骨结构。骨髓细胞分化为骨祖细胞的速率可借助于内皮细胞来控制。理想地，骨祖细胞应在诱导骨形成的部位保持在成骨前阶段，从而避免血管内的矿物沉积。从血管转移到诱导部位后，应该发生成熟成骨细胞的快速分化。

根据本发明，第一天的分离程序涉及利用活检收集介质在离心管中收集骨髓。根据标准流程检查含有活检物的活检收集介质的无菌性、细胞活力、细胞计数、细胞表征、透明度(clarity)和颜色。在无菌条件下用洗涤介质洗涤收集的样品几次。以1700rpm持续离心7分钟后，通过吸取移除不想要的碎片和脂肪(油脂)层。使红细胞裂解，并分离成核的骨髓细胞。

之后，用DMEM培养基(Dulbecco's改进的Eagle's培养基)洗涤分离的成核骨髓细胞，并通过40-μ滤器过滤以除去碎片。使用血细胞计数器对细胞进行计数。将同源细胞悬液与培养基一起接种在组织培养瓶中。