[发明专利]用于在核酸测定中改善解链分辨和多重性的探针

说明书

提供了用于检测和定量核酸的方法和组合物。在某些实施方案中，方法涉及使用包含在靶核酸分子的存在下对内切核糖核酸酶(例如，RNA酶H)切割易感的核糖核苷酸位置的可切割探针。实施方案的探针还可以包含与报告基团和/或淬灭部分连接的非天然核苷酸。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年8月11日提交的美国临时专利申请No 62/035,783的权益，其全部内容通过引用并入本文。

序列表的并入

包含在创建于2015年8月11日的8KB(在中测量)的名为“LUMNP0129WO_ST25.txt”的文件中的序列表通过电子提交的方式与本文一起提交，并通过引用并入。

发明背景

技术领域

本发明一般性涉及分子生物学领域。更特别地，其涉及核酸的检测。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体对DNA进行酶促复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、基因克隆、亲子鉴定和DNA计算。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。通常在PCR反应的终点(end-point)或者平台期进行DNA检测，这使得难以对起始模板进行定量。实时PCR或动态PCR通过记录反应过程中的扩增子浓度，从而提高了终点PCR分析的能力。最通常通过与被扩增的靶标有关的荧光信号的改变来记录扩增子浓度。实时PCR相对于终点检测的优势还在于，由于其在封闭的系统中进行，因此限制了污染。其它优势包括更高的灵敏度、动态范围、速度和需要较少的过程。

在实时PCR检测方法中已经采用了几种测定化学。这些测定化学包括采用双链DNA结合染料、双标记的寡核苷酸，例如发夹引物和发夹探针。然而，目前实时PCR的一个缺陷在于其受限的多重性(multiplexing)能力。目前的实时PCR技术采用在溶液中游离的报告荧光染料。在多重反应中，该设计必须在每个测定中采用光谱不同的荧光染料。例如，设计来检测4个靶序列的多重反应将需要能够通过光谱不同来区分4个不同的、游离漂浮的荧光染料的仪器，这还不包括对照。这些要求不仅限制了实际的多重能力，而且增加了成本，其原因在于这样的设备通常需要多个发射源、检测器和滤器。目前的实时PCR技术的多重能力为大约1-6重(plex)。

发明内容

本发明涉及用于扩增和检测DNA的系统和方法。特别地，本发明的实施方案提供了大大提高用于检测经扩增靶序列的可检测探针的多重能力的系统和方法。

在第一实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含标记物的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列(reverse complement)的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)延伸所述发夹探针；以及(e)通过检测标记物的信号改变来检测所述靶核酸。在某些方面，第一序列区(i)中的标记是报告基团-淬灭基团对，并且第一序列区上发夹探针的延伸改变报告基团和淬灭基团之间的距离；或用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸和第一序列区上发夹探针的延伸导致用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的互补非天然核苷酸的引入。在某些方面，所述为第二序列区的反向互补序列的序列(iii)的全部、一部分可与靶核酸第一链上的第一区互补或序列(iii)不与靶核酸第一链上的第一区互补。在一些实施方案中，所述方法还包括对发夹探针进行解链分析(melt analysis)。