[发明专利]使用CRISPR-CAS系统的多核苷酸富集

说明书

用于富集靶核酸的方法，其包括提供具有crRNA或其衍生物和Cas蛋白或其变体的内切核酸酶系统。crRNA或其衍生物包含与靶核酸的区域基本上互补的靶物特异性核苷酸区域；使所述靶核酸与所述内切核酸酶系统接触以形成复合物；并分离复合物，从而富集靶核酸。

本公开一般涉及富集多核苷酸的方法，更具体地涉及使用CRISPR-Cas系统富集多核苷酸的方法及其应用。

发明背景

存在有期望在多核苷酸群体中(例如在全基因组中)富集靶多核苷酸的多种方法和应用。此类方法和应用包括但不限于确定序列的存在以诊断病症或疾病。

目前用于序列特异性DNA富集的许多方法涉及多个步骤，并且需要相对大量的样品核酸，并且通常是困难的、繁琐的、费力的、费时的、低效的和昂贵的。此外，目前用于双链DNA的靶向富集的方法需要在序列特异性靶向之前创建单链DNA。它们还需要更长的时间将探针与靶DNA杂交。因此，需要能够实现快速和有效的序列特异性多核苷酸富集的新方法。本公开通过提供使用CRISPR-Cas系统富集多核苷酸的方法来满足这种需要。还提供相关优点。

在许多细菌和古细菌中，聚簇规则间隔短回文重复(CRISPR)涉及保护细胞免受噬菌体和接合接合质粒的干扰途径(Marraffini and Sontheimer,2010,Nat Rev Genet.11(3):181-190)。CRISPR由短重复序列阵列组成，所述短重复序列由称为间隔区的类似大小的独特可变DNA序列间隔开，所述序列通常来自噬菌体或质粒DNA(Barrangou et al.,2007,Science 315:1709-12；Bolotin et al.,2005,Microbiology 151:2551-61；Mojicaet al.,2005,J Mol Evol 60:174-82)。因此，CRISPR序列提供了过去感染的适应性、可遗传的记录并且表达CRISPR RNA(crRNA)-靶向侵入性核酸的小RNA(Marraffini andSontheimer,2010,Nat Rev Genet.11(3):181-190)。CRISPR通常与编码与CRISPR相关的蛋白质的CRISPR相关(Cas)基因相关。Cas蛋白可以提供破坏由crRNA靶向的侵入性外来核酸的机制。CRISPR与Cas(CRISPR相关的)基因一起包含对细菌和古细菌中侵入性外来核酸提供获得性抗性的适应性免疫系统(Barrangou et al.,2007,Science 315:1709-12)。

发明概述

本公开提供了用于富集多核苷酸的方法，并且更具体地涉及使用CRISPR-Cas系统富集靶DNA序列的方法及其应用。

一方面，本文提供了用于富集靶核酸的方法，包括提供内切核酸酶系统，所述内切核酸酶系统具有：聚簇规则间隔短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA)或其衍生物，和CRISPR相关的(Cas)蛋白或其变体，其中所述crRNA或其衍生物包含与所述靶核酸的区域互补的靶物特异性核苷酸区域；使所述靶核酸与所述内切核酸酶系统接触以形成复合物，并且分离所述复合物，从而富集所述靶核酸。

在一些实施方案中，所述方法还包括从复合物中分离靶核酸。在一些实施方案中，所述方法还包括扩增靶定核酸。

在一些实施方案中，本文提供的内切核酸酶系统还包含反式激活crRNA(tracrRNA)或其衍生物。在一些实施方案中，crRNA或其衍生物是含有与tracrRNA多核苷酸融合的crRNA多核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，内切核酸酶系统是II型CRISPR-Cas系统或其衍生物。在一些实施方案中，靶核酸是双链DNA(dsDNA)。

在一些实施方案中，内切核酸酶系统是标记的。在一些实施方案中，用生物素标记crRNA。在一些实施方案中，本文提供的方法还包括加入链霉亲合素，从而分离复合物。在一些实施方案中，Cas蛋白或其衍生物用捕获标签标记。