[发明专利]测定样品中PIK3CA突变状态的方法

说明书

本发明涉及用于检测癌症患者的生物样品中的PIK3CA突变的超灵敏和高度特异的方法，该方法基于来自以下项中的DNA样品的等位基因特异的、不对称快速PCR和解链分析的组合：循环肿瘤细胞(CTC)、血浆/血清中的无细胞DNA(cfDNA)、或福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPE)。使用针对外显子9和20(分别是E545K和H1047R)中的每个热点突变的等位基因特异性引物，根据本发明检测可以增强突变体PIK3CA等位基因序列的扩增，然而每个外显子的相应竞争性阻断未标记探针的存在可避免野生型PIK3CA序列的非特异性扩增，从而提高方法的灵敏度和特异性。使用未标记探针与突变体PIK3CA序列的DNA模板的解链曲线分析完成该突变检测。对癌症患者的外周血中的CTC及血浆/血清中的cfDNA的PIK3CA突变状态的评价是具有潜在临床应用的策略，并且可能对治疗性干预有重要影响，因为PIK3CA突变的存在与对分子靶向治疗的响应相关联。

技术领域

本发明涉及一种用于确定以下各项的DNA样品中PIK3CA突变状态的高灵敏度方法：例如，循环肿瘤细胞(CTC)、血浆/血清无细胞DNA(cfDNA)和福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。

背景技术

循环肿瘤细胞(CTC)检测和计数可以充当“液体活组织检查”及响应于全身治疗的早期标志物，而它们的分子表征具有被翻译为个体化靶向治疗并使癌症患者免遭不必要的和无效的治疗的强大潜力。

已经显示在辅佐化疗之前在7.5mL血液中对一个或多个CTC的检测可以准确地预测总体存活期(OS)。在随访的最初5年期间对CTC的持续检测与晚期疾病复发和死亡的风险增加有关，并指出化疗和激素治疗抵抗性残余疾病的存在。最近一项前瞻性临床研究证实一个或多个CTC的存在预测早期复发和减少的总体存活期(OS)。

在转移性乳腺癌(MBC)中，CTC代表无进展存活期(PFS)和OS的独立预后因素，而CTC计数测定法(enumeration assay)(CellSearch^TM系统，Veridex)由FDA批准用于转移性乳腺癌、前列腺癌、和结肠直肠癌。疗法的第二个周期之前增加的CTC数量是不良的PFS和OS的早期预测性标志物，并且可以用于监测治疗益处，然而接受治疗的CTC减少随着靶向疗法而更强。在一线治疗前患有MBC的患者中的CTC检测可以定义具有惨淡临床结果的患者的亚组。

现在确立的是，无细胞DNA(cfDNA)从经历细胞凋亡或其他由微环境胁迫诱导的生理事件的细胞释放到循环中并且可以在患有癌症的患者的血液样品中被鉴别。然而，与产生的cfDNA片段的长度(DNA完整性)相关，cfDNA的来源可以区别于凋亡或坏死原点。术语循环肿瘤DNA(ctDNA)基本上包括衍生自肿瘤的总cfDNA的一个亚型。许多研究表明，ctDNA和CTC两者不仅存在于晚期而且甚至存在于早期阶段的癌症患者的血浆/血清和外周血中。

虽然有许多可商购的cfDNA提取试剂盒，但是由于起始材料在提取过程中的损失，效率和产量仍然很低，并且因为缺乏标准化，其定量是可变的。尽管如此，cfDNA提取效率可以直接影响突变检测即测定灵敏度的结果。

磷酸肌醇3-激酶(PI3K)包括在20世纪80年代发现的脂质激酶家族，其负责调解重要的生物功能，例如细胞存活、分化和增殖。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号传导途径牵涉于包括癌症的人类疾病，并且理解此途径的复杂性可以为治疗性干预提供新途径。在PI3K的p110α催化亚基中的体细胞突变，在许多类型的实体癌如乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、食道癌、肺癌、脑癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、胃癌或甲状腺癌中是非常频繁的，并且在响应于分子靶向疗法中起关键作用并与乳腺癌中的HER-2扩增共同发生。PIK3CA的突变已经在18％-40％的乳腺癌患者中进行了报道，而绝大多数(包括大约90％的病例)聚集在外显子9与外显子20中的两个热点区域中。