[发明专利]用于检测样品中细菌ATP的包含ATP-二磷酸水解酶的试剂盒

说明书

本发明提供了一种用于检测样品中细菌ATP的试剂盒。该试剂盒包含具有约6.0至7.2的pH的水性组合物。该水性组合物包含有效量的多元醇、缓冲试剂、蛋白质和ATP‑二磷酸水解酶。还提供了一种使用该试剂盒检测细菌ATP的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年11月13日提交的美国临时专利申请62/079,156的优先权，该专利申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。

背景技术

需要对涉及工业过程的多种工业产品和其它样品(原材料、过程中样品、环境样品等)进行微生物污染测试。在一些情况下，最终产品必须是无菌的；在其它情况下，对所允许的微生物总数设定限制。经常对某些特定生物体的存在进行测试，并且此外可能对具体量的样品不存在要求或对所允许的数量可能有所限制。

传统上，这些测试涉及使用培养技术。然而，这些传统的测试方法很慢。通常，在健康的、快速生长的细菌或酵母形成足够大的菌落以在琼脂板上轻松计数之前，一般需要花费至少24小时。然而，许多样品含有在其开始繁殖之前需要恢复期的应激微生物或在常见类型的培养基上生长缓慢的生物体(包括霉菌)。因此，许多经过验证的培养方法需要24-48小时的孵育期，并且在一些情况下需要5天或更多。

现在许多微生物测试使用ATP生物发光反应检测从细胞(例如微生物细胞)中释放的ATP来更快速地进行。ATP是能量代谢的必要部分，并且因此是活生物体或其它有机物质存在的指示物。

这些测试利用荧光素酶。生物发光试剂含有荧光素酶以及尤其是荧光素酶的底物荧光素、镁离子和合适的缓冲剂。当向此试剂中添加腺苷-5'-三磷酸(ATP)时，荧光素酶催化光发射。测试结果记录为RLU(相对光单位)值。RLU值通常与存在于测试样品中的微生物量成比例。

某些样品(例如牛奶)可能含有相对高水平的与酪蛋白胶束相关的游离ATP和存在于体细胞中的ATP。在这些情况下，螯合剂可以用于破坏胶束，温和洗涤剂可以用于裂解体细胞，并且“非微生物”ATP可以使用三磷酸腺苷双磷酸酶(ATP水解酶)水解；从而能够实现对微生物ATP的检测。仍然需要简单、方便的检测微生物ATP的测试。

发明内容

本公开涉及包含在环境温度(例如约25℃)下格外稳定的ATP-二磷酸水解酶的水性组合物的试剂盒以及制备所述组合物的方法。已知包含ATP-二磷酸水解酶的基本干燥的组合物在0℃下是稳定的。还已知，当冷冻储存时，≥1mg/mL的ATP-二磷酸水解酶在水性组合物(pH 5-7)中可以是稳定的。甚至还已知1mg/mL的ATP-二磷酸水解酶可以储存在包含1mM MgCl₂、1mm DTT、1mM EDTA和1mg/mL牛白蛋白的水性组合物(pH 7.5)中。然而，还已知反复冻融循环和室温暴露数小时导致水性溶液中ATP-二磷酸水解酶活性的丧失。该组合物可以用于检测样品中细菌ATP的试剂盒中。

本公开的发明性的水性组合物在室温(例如约21-25℃)下储存至少28天之后令人惊奇地保留了大于或等于约90％的初始ATP-二磷酸水解酶活性。有利的是，在环境温度下水性溶液中ATP-二磷酸水解酶的这种稳定允许在用于检测ATP生物发光的试剂盒中使用水性组合物。

在一个方面，本公开提供了包含具有约6.0至7.2的pH的水性组合物的试剂盒。水性组合物可以包含有效量的多元醇、缓冲试剂、蛋白质和ATP-二磷酸水解酶。在任何实施方案中，多元醇可以包括山梨醇，缓冲试剂可以包括HEPES、Tris和琥珀酸盐的混合物，并且蛋白质可以包括牛血清白蛋白。