[发明专利]一种修饰模板双链多核苷酸的方法

权利要求书

1.一种修饰模板双链多核苷酸的方法，包括：

(a)使模板多核苷酸与MuA转座酶以及一群双链MuA底物接触，每个双链MuA底物包括(i)至少一个突出端和(ii)与包括所述至少一个突出端的链相对的链中的至少一个发夹环，使得转座酶将所述模板多核苷酸片段化并将底物连接到双链片段的一端或两端，从而产生多个片段/底物构建体；

(b)使所述片段/底物构建体与聚合酶接触，使得所述聚合酶置换包括所述突出端的链，并用与包括发夹环的链互补的链替换它们，从而产生多个双链构建体，每个所述双链构建体包括模板多核苷酸的双链片段；和

(c)分离所述双链构建体的两条链，并使用所述链作为模板以形成多个经修饰的双链多核苷酸，每个所述经修饰的双链多核苷酸包括由至少一个发夹环连接的两条互补链。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括通过增加pH、温度和离子强度中的一个或多个来分离所述双链构建体的两条链。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括使分离的链与聚合酶接触，使得所述聚合酶使用所述链作为模板以形成所述多个经修饰的双链多核苷酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括(i)使多个分离的链与一群核苷酸寡聚体接触，所述一群核苷酸寡聚体包括在所述寡聚体能够与所述链杂交的条件下与所述链中所有核苷酸互补的核苷酸的每种可能组合，和(ii)将那些与所述链杂交的寡聚体连接在一起以形成所述多个经修饰的双链多核苷酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括使所述多个双链构建体与聚合酶接触，使得所述聚合酶同时分离所述双链构建体的两条链，并将所述链用作形成所述多个经修饰的双链多核苷酸的模板。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个发夹环不连接每个底物的两条链。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个突出端长度为4、5或6个核苷酸。

8.根据权利要求1所述的方法，其中每个底物包括设计为有助于多核苷酸通过孔的运动的前导序列。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括(d)在发夹环的相对端将Y适配器连接到所述多个经修饰的双链多核苷酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述Y适配器包括设计为有助于多核苷酸通过孔的运动的前导序列。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括将一个或多个多核苷酸结合蛋白与所述多个经修饰的双链多核苷酸结合。

12.一群用于修饰模板多核苷酸的双链多核苷酸MuA底物，其中所述底物如权利要求1,6和7中任一项所定义，并且其中所述至少一个发夹环不连接每个底物的两条链。

13.一种表征模板多核苷酸的方法，包括：

a)使用根据权利要求1所述的方法修饰模板多核苷酸，以产生多个经修饰的多核苷酸；

b)使每个经修饰的多核苷酸与跨膜孔接触，使得每个多核苷酸的至少一条链移动通过所述孔；和

c)当每个多核苷酸相对于孔移动时获取一个或多个测量值，其中所述测量值指示每个多核苷酸的一个或多个特征，从而表征所述模板多核苷酸。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述经修饰的多核苷酸/每个经修饰的多核苷酸的两条链移动通过所述孔。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个特征选自(i)多核苷酸的长度，(ii)多核苷酸的同一性，(iii)多核苷酸的序列，(iv)多核苷酸的二级结构和(v)多核苷酸是否被修饰。