[发明专利]分析方法和用于其中的阵列

说明书

技术领域

本发明涉及用于鉴定能够诱发呼吸道致敏的试剂的方法以及用于这些方法中的阵列和分析试剂盒。

背景技术

呼吸道致敏是由针对环境蛋白质或某些低分子量(LMW)化合物的免疫应答引起的上呼吸道和下呼吸道过敏性I型超敏反应。呼吸道致敏的临床症状，包括喘息、支气管收缩和哮喘发作，在易于和先前致敏的个体中在反复暴露于相同化合物时产生[1]。在机制上，呼吸道致敏由CD4+Th2细胞的活化引发并通过过敏原特异性IgE抗体的产生增加进行B淋巴细胞的分化来介导[1-3]。

虽然呼吸道过敏通常由蛋白质过敏原引起，但是LMW化合物主要与涉及CD8+T细胞和CD4+Th1细胞的IV型超敏反应诱发以及皮肤病状如过敏性接触性皮炎(ACD)的发作有关。然而，某些类别的LMW化合物，例如二异氰酸酯[4]、酸酐[5]、铂盐[6]、活性染料[7]和氯胺T[8]，也可能对呼吸道致敏。对这些LMW化合物的暴露通常局限于职业环境，并且在长时间内反复暴露可能最终导致患上职业性哮喘(OA)[3、9]。虽然已知较少的化学物质引起呼吸道过敏(<100种已知物质)[10]，但与引起接触性皮炎的化学物质相比，健康影响仍然可以是灾难性的。例如，获得性OA可能导致慢性炎症、气道高反应性[11]、广泛性气道重塑[12]，因而严重影响受侵袭个体的生活质量。与OA相关的严重健康影响以及将新化合物引入工作环境(例如清洁剂和保健产品[9、13-15])强调需要准确且可靠的用于潜在呼吸道致敏物的危害分类的测试策略。因此，这些化合物的主动鉴定和表征仍然是非常重要的领域。

然而，在这方面的挑战是，引起呼吸道致敏的化学物质的风险评估方法极大地不发达[16]。目前的方法涉及体内和体外测试策略。直到最近，该领域仍依赖于基于动物的体内模型。在这些基于动物的方法中，豚鼠试验[17]、小鼠IgE试验[18、19]、大鼠IgE试验[20、21]和小鼠细胞因子指纹识别[22、23]得到了最多的关注。此外，文献[24、25]中描述了旨在区分呼吸道致敏物与皮肤致敏物的几种化学诱发哮喘鼠类模型。尽管这些方法无疑有助于目前对与呼吸道致敏发展相关的免疫生物学机制和细胞过程的理解，但是没有一种方法被证明是足够可靠的，以便出于调节目的用作常规测定法。另外，存在与使用基于动物的方法作为筛选工具相关的重大的经济和伦理缺点。

因此，已经作出了相当大的努力来开发基于细胞的呼吸道致敏体外测定，其与在Directive 201/63/EU[26]中所述的关于动物实验的减少(reduction)、优化(refinement)和替代(replacement)的3R原则相关。最近的基于细胞的方法已经涉及使用单细胞系作为致敏过程中不同阶段的模型，例如树突状细胞系THP-1[27]和上皮细胞系BEAS-2B[28]和A549[29]。还已使用由Epithelix开发的市售MucilAir^TM作为人类气道上皮的3D细胞模型，进行模拟呼吸道致敏物的体内暴露途径的更先进的尝试[30]。此外，在呼吸道致敏中正在探索基于化学反应性的非细胞基计算机预测模型[31]。

与缺乏呼吸道致敏的测定法相比，文献描述了用于鉴定皮肤致敏化学物质的几种预测模型(综述于[34]中)，其中基于动物的局部淋巴结测定法(LLNA)[35]历来是优选方法。还已经描述了几种用于皮肤致敏终点的体外模型，包括人类细胞系活化测试(h-CLAT)[36、37]、直接肽激活测试(DRPA)[38]和测试[39、40]。最近，我们还提出了我们内部开发的基因组过敏原快速检测(GARD)[41、42]体外测定法作为这些方法的准确替代方法。GARD测定法是基于使用全转录组DNA微阵列技术测量包含骨髓人类细胞系MUTZ-3[43-45]中的200个基因的基因组生物标志物签名(GARD预测签名或GPS)的转录水平。在最近的研究中，使用包含26种盲式化合物和11种非盲式化合物的群组来评估GARD测定法在预测性能方面的功能性。测定法的准确度估计为89％[46]，相比于LLNA为72％[47]。皮肤致敏模型是引入关注的，因为已经提出还可以应用皮肤致敏测定法如LLNA来分类呼吸道致敏物[48、49]。LLNA测定法中的终点是在将小鼠局部暴露于测试化学物质时在引流淋巴结中测量的引发增殖反应[50、51]。然而，这种增殖反应是由呼吸道致敏物和皮肤致敏物引起的。因此，虽然LLNA可用于致敏物与非致敏物的分层，但不能准确区分皮肤致敏物与呼吸道致敏物[1]。

因此，仍然需要建立准确且可靠的用于特异性鉴定呼吸道致敏物的体外测定法。