[发明专利]宫颈癌的生物标记物

说明书

本发明涉及用于检测针对宫颈癌的易感性的方法、试剂和试剂盒。特别地，本发明涉及新型甲基化标记物以改进对于宫颈上皮内瘤变级别2/3(CIN2/3)的筛查，并且涉及新型甲基化标记物在分离的样品中用于鉴定宫颈细胞为肿瘤或倾向于瘤变的用途。

技术领域

本发明涉及用于检测对宫颈癌的易感性的方法、试剂和试剂盒。具体而言，本发明涉及新的甲基化标记物以改善对子宫颈上皮内瘤变级别2/3的筛查，并且涉及新的甲基化标记物用于在分离样品中确定宫颈细胞为肿瘤或倾向于瘤变的用途。

背景技术

宫颈癌表征为明确的恶性前期，宫颈上皮内瘤变(CIN)。通过基于人口的筛查方案及其随后的治疗确定这些CIN病变导致宫颈癌发病率和死亡率显著降低^1,2。宫颈涂片的细胞学检测是使用最广泛的宫颈癌的筛查方法，但不太理想，因为CIN2及更高级别(CIN2+)的检测灵敏度仅为约55％^3-5。宫颈癌发生与高危人乳头瘤病毒(hrHPV)高度相关⁶。大型随机控制试验表明，hrHPV检测的灵敏度显著高于细胞学检测^4,7-10。然而，hrHPV测试的特异性，特别是在年轻筛查人群中，是相对较低的^3,11-13，这可能导致妇科医生不必要的转诊、假阳性妇女的焦虑，以及健康护理系统的更高成本。最后，在不久的将来，在以hrHPV接种疫苗引入初级预防的国家中，CIN和宫颈癌的患病率可能会降低。随着该患病率普遍降低，目前筛查测试的阳性预测值将按定义降低¹⁴。因此，需要具有高敏感性和高特异性的其他客观的生物标记作为宫颈癌的新的筛查工具。

在相对于(前)恶性病变的正常情况中，不同的DNA甲基化模式代表基于甲基化特异性PCR(MSP)的诊断方法的良好靶标。肿瘤抑制基因的启动子的高甲基化是宫颈癌发生的早期事件，并且因此高甲基化分析对于早期检测宫颈瘤可以是特别相关的^15-17。评价宫颈刮片(刮试物，scraping)中的甲基化标记物用于检测CIN和宫颈癌而是可行的^17-23。还参见WO2006/007980。然而，寻找具有高灵敏度和高特异性的甲基化标记物仍然是一个挑战。

通过这些年逐渐开发出更精细的方法，以便在全基因组范围内识别新的甲基化标记物²⁴。在其他团队的相似研究中，我们以前报道了我们与再表达相结合而在药理学上揭露启动子区域的经验，如通过OpenArray平台上的微阵列、高通量定量甲基化特异性PCR(QMSP)和甲基-DNA免疫沉淀，随后的微阵列分析(MeDIP)所分析的，这导致基因C13ORF18、JAM3、EPB41L3和TERT的发现和证实^21,22,25。也参见WO2009/115615。这些基因的诊断性能表明检测hrHPV阳性人群中的CIN2+的敏感性介于43％-71％之间，且特异性介于89％-100％之间²¹。然而，迄今为止，发现新的甲基化标记物的策略都是基于癌症和正常组织之间的差异，导致标记物对癌症具有高灵敏度，但对于检测CIN2/3病变的灵敏度太低。在我们的MeDIP研究中，分析了正常情况和CIN3病变的DNA甲基化组。然而，这种技术的缺点在于它主要识别大量高度甲基化的重复DNA，导致特异性较低。

发明内容

因此，本发明人开始确定和验证能够区分正常宫颈和CIN2/3病变的新的甲基化标记物。为此，开发了一种针对CIN2/3病变与正常宫颈组织的DNA的新颖且更特异的创新型全基因组甲基化分析。应用了甲基化-CpG岛恢复测定法(MIRA)，该方法使用人MeCP2的抗体偶联的甲基结合结构域(MBD)以特异性纯化甲基化DNA。与MeDIP分析相比，MBD复合物对双链CpG-甲基化DNA的较高亲和力导致甲基DNA序列富集度更高。随后下一代测序揭示所确定的新甲基化区(MethylCap-seq)。宫颈刮片的诊断评价表明，对于8个新确定的基因，甲基化的相对水平随潜在组织学病变的严重程度而增加。新的甲基化标记能够在来自群体基筛查的hrHPV阳性妇女中有利地应用为分诊测试。据发现，标记物的组合将会提供改进的诊断价值。