[发明专利]精氨酸提高聚合酶储存稳定性

说明书

相关专利申请的交叉参考

本申请要求2014年11月25日提交的美国临时专利申请号62/084,505的优先权，该文通过引用纳入本文。

发明背景

对于各种应用，天然或重组热稳定聚合酶已广泛用于热循环链式反应，例如PCR或qPCR，用于各种应用。对于长期储存稳定性，热稳定聚合酶通常储存在含有一种或多种非离子型洗涤剂，例如NP-40，吐温20，和曲通X的缓冲液中。参见例如美国专利6,127,155。根据美国专利申请2008/0064071 A1和2010/0099150 A1，还发现两性离子洗涤剂如CHAPS，CHAPSO和Surfynol增强聚合酶储存稳定性和活性，尽管以前的出版物表明两性离子洗涤剂，如CHAPS可潜在地造成蛋白质变性(Hielmeland，1980)。

发明内容

在一些实施方式中，本文提供了用于储存多核苷酸操纵酶(例如本文所述的聚合酶或其它酶)的液体储存溶液。在一些实施方式中，所述溶液包含酶(例如聚合酶或限制性内切酶)，游离精氨酸或其盐或精氨酸衍生物(例如但不限于精氨酸乙酯，精氨酰胺二盐酸盐)或其盐，和5％或更多的冷冻保护剂。在一些实施方式中，所述冷冻保护剂是二醇，三醇，多元醇，一元醇或亚砜。在一些实施方式中，所述游离精氨酸或其盐或精氨酸衍生物或其盐的浓度是0.01-5M(例如0.01-2.5M)。

在一些实施方式中，所述储存溶液还包含一种或多种缓冲剂，KCl，乙二胺四乙酸(EDTA)，或二硫苏糖醇(DTT)。在一些实施方式中，所述液体溶液包含缓冲剂并且该缓冲剂是Goods缓冲剂。在一些实施方式中，所述Goods缓冲剂选自下组：MES，BIS-TRIS，ADA，ACES，PIPES，Bis-6Tris丙烷，MOPSO，BES，MOPS，TES，HEPES，DIPSO，MPOS，TAPSO，HEPPSO，POPSO，EPPS，N-三(羟甲基)甲基甘氨酸，TRIS，AMP，重碳酸盐，N-二(羟乙基)甘氨酸，硼酸盐，卡可酸盐，CAPS，CAPSO，CHES，柠檬酸盐，DIPSO，甘氨酸，甘氨酰甘氨酸，磷酸盐，TAPS，TAPSO和TEA。

在一些实施方式中，所述精氨酸或其盐或精氨酸衍生物或其盐浓度是0.1-1.0M。

在一些实施方式中，所述溶液缺乏足以维持模板多核苷酸的聚合的组分。在一些实施方式中，所述溶液缺乏以下至少一种：模板多核苷酸；或寡核苷酸引物。

在一些实施方式中，所述溶液温度是-80到5℃。在一些实施方式中，所述溶液温度是-30到5℃。在一些实施方式中，所述溶液温度是-80到10℃。在一些实施方式中，所述溶液温度是-80到50℃。在一些实施方式中，所述溶液温度是-80到90℃。在一些实施方式中，所述溶液温度是-80到100℃。

在一些实施方式中，所述溶液不含洗涤剂。在一些实施方式中，所述溶液包含一种或多种洗涤剂。

在一些实施方式中，所述溶液不含三糖。

在一些实施方式中，所述聚合酶是热稳定聚合酶。

在一些实施方式中，所述聚合酶是反转录酶。

在一些实施方式中，所述聚合酶是或包括B家族聚合酶。

还提供了在储存期间保持聚合酶稳定性的方法。在一些实施方式中，所述方法包括提供如以上所述或他处所述的液体溶液；和，储存溶液至少3(例如至少7，14，21，28，50，100)天。在一些实施方式中，所述储存发生在-80和5℃之间。在一些实施方式中，所述储存发生在-80和10℃之间。在一些实施方式中，所述储存发生在-80和50℃之间。在一些实施方式中，所述储存发生在-80和90℃之间。在一些实施方式中，所述储存发生在-80和100℃之间。在一些实施方式中，所述方法还包括在储存后，在酶促反应中使用该聚合酶。

例如，在一些实施方式中，所述方法包括提供包含所述酶(例如聚合酶或限制性内切酶)和0.01-5.0M精氨酸或其盐或精氨酸衍生物或其盐的液体溶液；和，储存所述溶液至少3(例如至少7，14，21，28，50，100)天。在一些实施方式中，所述储存发生在-80和5℃之间。在一些实施方式中，所述储存发生在-80和10℃之间。在一些实施方式中，所述储存发生在-80和50℃之间。在一些实施方式中，所述储存发生在-80和90℃之间。在一些实施方式中，所述储存发生在-80和100℃之间。在一些实施方式中，所述方法还包括：在储存后，在酶促反应中使用该聚合酶。

定义