[发明专利]通过电穿孔高效率、高通量产生遗传修饰哺乳动物

权利要求书

1.一种产生遗传修饰哺乳动物的方法，所述方法包括通过电穿孔将材料引入到哺乳动物的配子或植入前期胚胎中以修饰所述哺乳动物的基因组。

2.权利要求1所述的方法，其中将所述材料引入到所述配子中。

3.权利要求2所述的方法，其中所述配子是卵子或卵。

4.权利要求2或3所述的方法，其还包括将所述配子与相反性别的配子融合，并允许发育成活胎产的遗传修饰哺乳动物。

5.权利要求1所述的方法，其中所述植入前期胚胎是1-细胞胚胎(即，合子)、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、早期桑椹胚或晚期桑椹胚。

6.权利要求5所述的方法，其还包括允许使所述(电穿孔的)植入前期胚胎发育成活胎产的遗传修饰哺乳动物。

7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述材料包含多核苷酸、多肽或两者。

8.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸包含II型Cas9蛋白的编码序列。

9.权利要求7或8所述的方法，其中所述多核苷酸包含规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统指导RNA，其与所述哺乳动物的基因组中的靶序列杂交。

10.权利要求9所述的方法，其中所述II型Cas9蛋白与所述CRISPR-Cas系统指导RNA的编码序列的浓度比是至少约1:1、至少约1.5:1、至少约2:1、至少约2.5:1、至少约3:1或更高。

11.权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述II型Cas9蛋白的编码序列的浓度是至少约40ng/μL、至少50ng/μL、至少100ng/μL、至少150ng/μL、至少200ng/μL、至少300ng/μL、至少400ng/μL、至少500ng/μL、至少600ng/μL、至少800ng/μL、或至少1000ng/μL或更高。

12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述材料还包含供体多核苷酸。

13.权利要求12所述的方法，其中所述供体多核苷酸是线性或环状双链DNA分子。

14.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸包含对所述哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性的转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)的编码序列。

15.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸包含对所述哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性的锌指核酸酶(ZFN)的编码序列。

16.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸包含对所述哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性的BuD衍生核酸酶(BuDN)的编码序列。

17.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸包含随机整合到所述哺乳动物的基因组中的DNA。

18.权利要求7-17中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含DNA载体。

19.权利要求7-18中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含RNA。

20.权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人、非人灵长类动物(例如狨、猕猴、黑猩猩)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、仓鼠、棉鼠、裸鼹鼠)、兔、家畜哺乳动物(例如山羊、绵羊、猪、奶牛、牛、马、骆驼)、宠物哺乳动物(例如狗、猫)、动物园哺乳动物、有袋类动物、濒危哺乳动物及其远系繁殖或随机繁殖群体。

21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中将所述配子(在与相反性别的配子融合之后)或所述植入前胚胎在电穿孔后移植到能够承载所述胚胎到分娩期的假孕宿主哺乳动物中。

22.权利要求21所述的方法，其中在移植到所述假孕宿主哺乳动物中之前，将所述配子(在与相反性别的配子融合之后)或所述植入前胚胎从在其中进行电穿孔的培养基中移除。

23.权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物的基因组通过一个或多个碱基对的插入或缺失、通过异源DNA片段的插入、通过内源DNA片段的缺失、通过内源DNA片段的倒位或易位，或其组合修饰。