[发明专利]非编码RNA用于细胞培养和选择的方法及组合物

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年10月3日提交的美国临时申请62/059,573号的权益和优先权，该专利的全文作为参考并入本申请。

背景技术

每年，由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞制造价值数十亿美元的生物制品，诸如抗体、疫苗和蛋白。即使CHO细胞的产量的小改进都能够产生巨大的经济影响。过程开发关注于获得最大量的活性产物，目的基因(Gene of Interest，GOI)。能够以两种主要的方式实现生产的优化以实现更高的GOI重组蛋白产量。第一种途径是增加过程的细胞密度(即，每体积细胞数)。这可以通过过程开发(例如，分批、补料、灌注等)和生长介质改进来完成。通过增加每日每体积细胞数，可以生产更高水平的产物。在过去20年期间，从约0.1-0.3g/L至今天的2-10g/L的抗体的产物浓度增加主要是通过工艺和介质的改进而实现，而同时单个细胞的比生产率没有以相似的程度增加。由于固有的大小限制，限制了细胞密度的进一步增加，所以未来的生产率改进需要通过选择具有极高且有效的生产率q(即，每细胞产生的GOI量)的细胞的改进来达成。

第二种途径致力于通过细胞系开发来增加比生产率。细胞系开发可以包括亚克隆细胞系以选择高产克隆和使用基因扩增两者。抗药性已经成为生物制药产业中用于通过组合GOI和可选择基因来诱导基因扩增以完成生产水平的提高的选择工具。在CHO细胞中常用的两种基因扩增系统是使用耐氨甲蝶呤(MTX)性的二氢叶酸还原酶(DHFR)系统以及使用耐蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)性的谷氨酸合成酶(GS)系统。通过例如利用GOI构成的重组DNA和DHFR的基因来转化细胞，并随后以逐渐升高的MTX水平培养它们而完成基因扩增。DHFR酶催化叶酸向四氢叶酸的转化，同时MTX抑制四氢叶酸的生成，从而从细胞剥夺核苷前体(次黄嘌呤和胸腺嘧啶)并最终杀死细胞。因此选择具有增加的DHFR基因拷贝数且因此四氢叶酸水平更高的CHO细胞。使用每细胞生产率途径，科学家们获得了比最初的非常低的水平多超过1000倍的增加的表达水平。

图1所示例的细胞系开发过程本身受限于：(1)涉及的时间长，当前大公司中利用集平台技术(set platform technology)的细胞系开发为4-9个月；以及(2)工作量，其通常涉及大约5,000个克隆的初始试验。大部分cGMP过程在转染后在池(pool)中开始进行。在池扩增步骤后的添加抗生素后存在一个用于恢复的两周的延迟(同时MTX或者MSX的浓度增加)。在好的池(good pools)的亚克隆(两周)和2,000-5,000候选项的初始试验后，需要另外2-3周用于恢复。从那些候选项中选出约300个系并且放置于小振荡管(5-10mL)以用于两周后的下一轮测试。典型地，为下一阶段选择60个以上的候选项，并且在2周过程中每个必须在独立的125mL振荡烧瓶中独立生长并进行分析。随后对这60个进行产物质量属性的评估，并且选择10个在2-6升的容器中进行稳定性测试和小生物工艺测试。需要4周用于扩增和生物工艺运行，以及潜在地在增大的容器中进行4个月持续的稳定性测试。初始时仅针对生产率进行选择，并且之后针对更大规模，评估更重要的产物质量。

CHO过程开发关注于最大化被称为目的基因(GOI)的活性产物的量，同时确保可能的最好质量。使用耐药性基因作为可选择的代表(proxy)是用于选择成功转化的、随后将进行用于GOI生产的亚克隆的CHO细胞的现行标准。这一基本途径在近20年大体未改变，但其具有两个主要缺陷。第一，现行方法要求能够与GOI竞争有限的细胞资源的额外抗生素抗性基因的生产，导致细胞额外的代谢消耗。第二，虽然频繁引入至相同的载体中，但抗生素抗性基因或抗生素选择基因的表达是一种代表而不直接与GOI关联，其能够造成最终GOI产率的错误预期并且导致高成本的非生产性细胞的维持。事实上，现行正向选择技术有效率仅为50％～90％，这是因为可选择标记物的生产不直接与GOI生产关联。(见Fan,L等，(2012)BIOTECHNOL BIOENG 109(4):1007-15和Kim,Y.G.等，(2012)BMC Biotechnol 12:24)。在扩增过程期间，例如，当基因拷贝数因为DNA复制误差而增加时，选择压力在选择的标记基因的扩增上，而GOI仅由于与选择标记物近似才被二次扩增。因此，扩增不含GOI的选择的标记基因的细胞实际上具有选择优势，因为其仅生产一种外源基因。