[发明专利]一种基于多重PCR的目标区域富集方法和试剂

说明书

提供一种基于多重PCR的目标区域富集方法和试剂，该方法包括：在含待富集目标区域的核酸片段两端分别连接第一接头和第二接头，得到接头连接产物；使用特异性结合第一接头的第一引物和特异性结合第二接头的第二引物，对接头连接产物进行PCR扩增，得到扩增产物，其中第一引物或第二引物具有第一亲和标记；通过固相载体捕获扩增产物中带有第一亲和标记的单链；以捕获的单链为模板，使用第三引物进行单引物线性扩增；以线性扩增产物为模板，使用第三引物和第一引物进行指数扩增，得到包含目标区域的产物。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于多重PCR的目标区域富集方法和试剂。

背景技术

随着DNA测序技术的发展，高通量测序技术已被广泛地应用于生命科学研究的各个领域。尽管随着测序技术的不断更新和普及，测序技术的成本也越来越低，但全基因组测序技术本身的花费还是很昂贵。用于调和这一问题的较好的方案是将感兴趣的目标区域富集出来，再进行高通量测序。传统的序列捕获技术，通常是将高通量测序文库构建好后，利用探针进行目标区域的文库富集再测序。

除此之外Life Tech公司基于多重PCR技术开发了一种称为Ampliseq的试剂盒，可以通过多重PCR过程实现目标区域的富集，从而大大缩减了杂交捕获这个耗时的操作过程，可以称为区域捕获技术的一项革新。

但是Ampliseq对于细胞游离DNA的目标区域富集却无能为力，因为细胞游离DNA具有片段小的特点，其长度甚至已经小于Ampliseq试剂盒PCR产物的长度；除此之外，基于Ampliseq的区域捕获技术只有在PCR后才能够实现样本之间的混合建库，这将使一个比较耗时的过程。

发明内容

本发明提供一种基于多重PCR的目标区域富集方法和试剂，能够实现细胞游离DNA这种短片段的区域捕获，并且大大减小区域捕获的时间和成本。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种基于多重PCR的目标区域富集方法，包括如下步骤：

在连接酶作用下，在含待富集目标区域的核酸片段两端分别连接第一接头和第二接头，得到接头连接产物，其中第一接头包括用于后续PCR扩增的第一接头固定序列、用于标记不同样本的第一标签序列和用于标记不同目标区域分子序列的第二标签序列；

使用特异性结合第一接头固定序列的第一引物和特异性结合第二接头的第二引物，对接头连接产物进行PCR扩增，得到扩增产物，其中第一引物或第二引物具有第一亲和标记；

通过固相载体捕获扩增产物中带有第一亲和标记的单链，其中固相载体上带有能够与第一亲和标记亲和结合的第二亲和标记；

以捕获的单链为模板，使用第三引物进行单引物线性扩增，其中第三引物包括5’端的第三引物固定序列和3’端的目标区域特异性结合序列；

以线性扩增产物为模板，使用第三引物和第一引物进行指数扩增，得到包含目标区域的产物。

作为本发明的优选方案，第一标签序列为5-10个碱基长度的序列，第二标签序列为10-12个碱基长度的随机序列。

作为本发明的优选方案，含待富集目标区域的核酸片段为末端修复过的核酸片段。

作为本发明的优选方案，第一引物具有第一亲和标记。

作为本发明的优选方案，第一亲和标记为生物素标记，第二亲和标记为链霉亲和素标记，固相载体为磁珠。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种基于多重PCR的目标区域富集试剂，包括如下组成部分：

第一接头和第二接头，用于在连接酶作用下分别连接到含待富集目标区域的核酸片段两端，以得到接头连接产物，其中第一接头包括用于后续PCR扩增的第一接头固定序列、用于标记不同样本的第一标签序列和用于标记不同目标区域分子序列的第二标签序列；