[发明专利]使用土壤杆菌属细菌向高粱属植物导入基因的方法及高粱属植物的转化植物的制备方法

说明书

本发明的课题在于，提供一种比现有公知的土壤杆菌法的效率高的高粱属植物的基因导入方法及转化植物制备方法。本发明提供一种高粱属植物的基因导入方法，其特征在于，在制备高粱属植物的植物组织材料的工序、接种土壤杆菌属细菌的工序和/或共存工序中，使用提高了氮源浓度和/或无机离子浓度的培养基，所述无机离子选自镁离子、钾离子、钙离子及钠离子。本发明还提供一种转化植物的制造方法，其特征在于，使用本发明的基因导入方法。

技术领域

本发明涉及通过土壤杆菌属细菌向高粱属植物进行基因导入的方法。本发明还涉及通过土壤杆菌属细菌制备高粱属植物的转化植物的方法。

背景技术

高粱是原产于非洲的禾本科的短日照单子叶植物。高粱的水利用效率高，耐干性、耐高温性优异，是仅次于玉米、水稻、小麦、大麦的主要谷类，在非洲、亚洲诸国是重要的粮食。另外，高粱含糖量高，也是生物乙醇的原料，因此，广泛进行用于改善高粱的农业性状的技术开发。高粱的全部基因组被破译，高粱特有的与有用农业性状相关的基因、数量性状基因座(QTL)的分析也在进行。可以认为，高粱的基因重组技术的开发在改善高粱的农业性状方面发挥了重要作用。

在作为主要谷类的大麦、小麦、玉米、水稻等单子叶植物的转化方法中，已知有聚乙二醇法、电穿孔法、基因枪法等物理化学方法(DNA的直接导入法)和利用土壤杆菌属细菌具有的功能的生物学方法(DNA的间接导入法)。通过土壤杆菌属细菌的基因导入法(以下称为土壤杆菌法)通过控制Ti质粒的病原性区域(vir区域)中的基因群的表达等，目标基因的导入拷贝数保持得较低，片段化而导入的情况少。因此，在得到的转化体中，能够较多地得到目标基因高表达的个体，与直接导入法相比，具有表达量的个体间差异小这一较大的优点。

土壤杆菌法被普遍地用作双子叶植物的转化法。原本认为，自然界中的土壤杆菌属细菌的宿主限定于双子叶植物，长时间不寄生于单子叶植物。然而，通过对供试组织的研究、培养基组成的改良、土壤杆菌属细菌株的选定等详细的研究，结果是首次报告了在作为主要谷物的水稻中通过土壤杆菌属细菌的高效转化方法(Hiei et al.1994：非专利文献1)。然后，紧接着水稻中的成功，还报告了在玉米(Ishida et al.1996：非专利文献2)、小麦(Cheng et al.1997：非专利文献3)、大麦(Tingay et al.1997：非专利文献4)、高粱(Zhaoet al.2000：非专利文献5)中通过土壤杆菌进行的转化的成功。

1.基于土壤杆菌法的高粱转化方法的相关现有技术

1)接种土壤杆菌的植物组织

作为用于接种土壤杆菌的高粱组织，使用了未成熟胚(非专利文献5)。

2)前处理

作为提高基于土壤杆菌法的转化效率的方法之一，对若干种单子叶植物的转化使用了对进行转化的植物材料实施热处理或离心处理的方法(Hiei et al.2006：非专利文献6)。还报告了，在高粱中通过对使土壤杆菌感染前的未成熟胚在43℃条件下进行3分钟的处理，使转化效率比未处理区提高约3倍(Gurel et al.2009：非专利文献7)。但是，关于离心处理，记载了对高粱的转化产生了负面的结果。

3)共存工序

将土壤杆菌接种于植物组织使其共存的工序。在通过土壤杆菌进行的高粱转化中，作为共存培养基的组成，使用了含有1倍量MS无机盐的MS培养基(非专利文献5)。

4)愈伤组织形成工序

愈伤组织形成工序是使植物组织脱分化(dedifferentiation)的工序。