[发明专利]使用同源重组改造间充质干细胞

权利要求书

1.一种将目的多核苷酸引入间充质干细胞的基因组中安全港基因座的方法，所述方法包括

将以下引入到所述间充质干细胞中：(a)上游的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)，其包括与DNA切割结构域连接的上游DNA结合结构域，其中所述上游DNA结合结构域特异性结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的上游位点处的安全港基因座，(b)下游的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)，其包括与DNA切割结构域连接的下游DNA结合结构域，其中所述下游DNA结合结构域特异性地结合所述间充质干细胞基因组中在基因组插入位点的下游位点处的安全港基因座，和(c)单链或双链供体多核苷酸，其包括正义链多核苷酸突出端和/或反义链多核苷酸突出端，当在所述基因组插入位点处切割时，其与相应的被切割的基因组DNA的多核苷酸突出端互补，其中所述互补的突出端促进所述供体多核苷酸与所述被切割的基因组DNA的同源重组，

从而将所述供体多核苷酸引入进所述基因组插入位点，进入所述间充质干细胞基因组的安全港基因座。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述上游TALEN与位于所述插入位点侧翼的基因组DNA基因座的正义链结合，并且所述下游TALEN与位于所述插入位点侧翼的基因组DNA基因组的反义链结合。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述引入包括核转染。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述引入包括使用核转染素(nucleofectin D).

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其包括以约1:1:1的比例使所述间充质干细胞与所述上游TALEN、所述下游TALEN和所述目的多核苷酸接触。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述供体多核苷酸编码用于诱导所述间充质干细胞增殖和/或分化成所选的成熟的细胞和/或组织的试剂，所述成熟的细胞和/或组织选自脂肪细胞、软骨、骨、肌腱、肌肉、皮肤、肌细胞、神经元和胶质细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述试剂是营养剂或生长因子。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述供体多核苷酸编码可选择的标志物和/或可检测的标记。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述供体多核苷酸包括谱系特异性启动子，所述谱系特异性启动子以可操作的方式与所述可选择的标志物和/或可检测的标记连接。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述安全港基因座是AAVS1。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述安全港基因座是CYBL。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体多核苷酸编码多肽。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述下游TALEN包括SEQ ID NO：11。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA切割结构域包括FokI核酸酶结构域。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述FokI核酸酶结构域包括SEQ ID NO：13。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合所述上游TALEN的基因组正义链基因座包括SEQ ID NO：1。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合所述下游TALEN的基因组反义链位点包括SEQ ID NO：3。

18.根据权利要求1所述的方法，其中将所述供体多核苷酸插入进同一染色体的两个拷贝中。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述上游TALEN包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或者SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述下游TALEN包括SEQ ID NO：11所示的序列。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞包含每条染色体的两个拷贝，并且其中将所述多核苷酸插入到同一染色体的所述两个拷贝中。