[发明专利]具有化学修饰的指导RNA

权利要求书

1.一种合成的指导RNA，其包含：

(a) crRNA区段，其包含(i)能够与多核苷酸中的靶序列杂交的指导序列，(ii)茎序列；和

(b) tracrRNA区段，其包含与所述茎序列部分或完全互补的核苷酸序列，

其中所述合成的指导RNA包含修饰，且其中所述合成的指导RNA具有gRNA功能性，

其中，所述修饰包括对修饰的核苷酸的糖和磷酸二酯键两者的修饰，所述修饰的核苷酸位于所述指导RNA的5’端或3’端的5个核苷酸之内。

2.权利要求1的合成的指导RNA，其中所述修饰的核苷酸包含2’-O-甲基模块、2’-O-甲氧基乙基(MOE)模块、2’-脱氧模块、硫代磷酸酯核苷酸间连接、膦酰基乙酸酯(PACE)核苷酸间连接、或硫代膦酰基乙酸酯(硫代PACE)核苷酸间连接。

3.权利要求1或2的合成的指导RNA，其在所述指导RNA的5’端包含少于26个连续的2’-O-甲基修饰。

4.权利要求1或2的合成的指导RNA，其进一步包含置换所述合成的指导RNA中的胞嘧啶的Z碱基，其中所述Z碱基具有如下通式：

。

5.权利要求1或2的合成的指导RNA，其在对应于尿嘧啶的位置进一步包含至少一个2-硫尿嘧啶，所述尿嘧啶能参与与潜在脱靶序列的U-G摇摆配对。

6.权利要求1或2的合成的指导RNA，其中所述修饰的核苷酸选自下组：具有3’-硫代磷酸酯基团的2’-O-甲基核苷酸、具有3’-膦酰基乙酸酯基团的2’-O-甲基核苷酸、具有3’-硫代膦酰基乙酸酯基团的2’-O-甲基核苷酸和具有3’-膦酰基乙酸酯基团的2’-脱氧核苷酸。

7.权利要求1或2的合成的指导RNA，其包含选自下组的三个连续的修饰的核苷酸：具有3’-硫代磷酸酯基团的2’-O-甲基核苷酸、具有3’-膦酰基乙酸酯基团的2’-O-甲基核苷酸、具有3’-硫代膦酰基乙酸酯基团的2’-O-甲基核苷酸。

8.权利要求1或2的合成的指导RNA，其包含至少两个修饰。

9.权利要求1或2的合成的指导RNA，其包含多至50个修饰。

10.权利要求1或2的合成的指导RNA，其包含单RNA链或两条分离的RNA链，以及在各条RNA链的5’端、各条RNA链的3’端、或各条RNA链的5’端和3’端二者处的一个或多个修饰。

11.权利要求10的合成的指导RNA，其在5’端或3’端包含或在5’端和3’端各包含7个或更少的连续的修饰核苷酸。

12.权利要求11的合成的指导RNA，其在5’端、3’端或茎-环的一个或多个处进一步包含一个或多个5-甲基尿苷核苷酸。

13.权利要求1或2的合成的指导RNA，其进一步包含荧光染料或标签。

14.权利要求13的合成的指导RNA，其中所述荧光染料或标签与所述合成的指导RNA的茎-环结合。

15.一种用于基因组编辑以修饰DNA序列、或调控目的基因表达、或切割靶多核苷酸的方法，其包括：将所述DNA序列、目的基因、或靶多核苷酸与CRISPR-相关蛋白及权利要求1-14中任一项的合成的指导RNA接触，并编辑、调控或切割所述DNA序列、目的基因、或靶多核苷酸。

16.权利要求15的方法，其中所述方法在体外进行，且所述合成的指导RNA在整个指导序列包含15个或更多的2’-O-甲基修饰。