[发明专利]解冻方法和设备

说明书

技术领域

本发明涉及解冻样品（具体地，包括生物材料的样品）的方法。本发明还涉及用于解冻样品（尤其是包括生物材料的样品）的设备。

背景技术

冷冻保存是一项广泛采用的技术，其被用以维持生物样品的长期生存能力以便在医学、生物技术和兽医科学中的后续应用。为了在解冻时获得高生存能力，必须在以受控的冷却速率冻结样品之前添加保护性化合物（冷冻保护剂）。冷冻保护剂溶解在样品中的水中并起到防止冰晶形成的作用，冰晶能够通过晶体形成损伤生物细胞材料而且当晶体解冻时也损伤生物细胞材料。用于冷冻保存的样品通常放置在诸如以下各项的专业冷冻容器中：

a)吸管，其是直径为2至4 mm且长度高达140 mm的薄壁管，且具有0.2 ml至0.5 ml的容量，

b)螺旋盖冷冻小瓶（cryovial），其为直径更宽（直径为近似12 mm）的短管，且具有0.5 ml至5.0 ml的容量，

c)具有从0.2 ml至50 ml的容量范围的气密密封的冷冻小瓶（诸如Aseptic Technologies Crystal小瓶、Cook Cell Seal小瓶或由West Pharma Daikyo供应的那些小瓶），

d)设计成用于更大的体积的冷却保存的柔性袋，其具有从5 ml至1000ml的容量，

e)多孔板、矩阵管（matrix tube）和在机器人与高通量筛选中所采用的其他SBS形式。

取决于待冻结的样品的量，所有冷冻容器中的填充体积都能够从几乎空到满之间变化。此外，小瓶容器通常在垂直地竖立时被填充和冻结，从而意指冻结材料/空气界面驻留在小瓶内的高度可根据处理的不同而变化。

在冻结之后，样品通常被存储在低温（常常为液氮的温度（-196°C））下，不过在一些应用中样品能够被存储在更暖的温度下。当需要时，解冻样品，且本领域中通常认为解冻过程应尽可能地快以在不过度加热细胞（这降低它们的生存能力）的情况下确保细胞生存能力。在当前方法中，通常通过以下方法实现解冻：将样品放置在维持在37°C下的水浴中，并且当大致所有冰或含水成分均已熔化时移除样品。尽管已做出一些尝试来使用IR辐射和磁场/电子场向样品传递能量，但样品解冻的大多数方法最终采纳热传导的使用以通过样品容器的壁传递能量。

如上文所论述，通常相信，低速率的解冻对细胞的恢复是有害的。就细胞损伤的机制而言，解冻的最优理论方法是实现从冷冻存储温度到最终产品温度（常常为4°C）的瞬时且均匀的温度上升。然而，在实践中，这在物理上是不可能的。

在实现生物样品中的快速暖化方面的主要根本物理约束与系统的热质量、冷冻材料的熔化焓、容器壁的热导率及样品的液相和固相相关联。在大多数系统中，通过加热容器的壁将能量传递到生物样品。为使加热时间最小化，应使施加热的速率（或功率）最大化。对于理想化的1维稳态跨过壁的热传导而言，能够使用以下公式：

其中P是通过经历加热的横截面面积A所传输的功率，k是壁的热导率，且dT/dx是跨过壁的温度梯度。

在冷冻小瓶的情况下，该等式表明为使通过传导传递至冷冻容器中的功率最大化，仅一个变量（温度梯度）是可直接控制的。冷冻容器壁的热导率、其横截面面积及其厚度（dx）都是由冷冻容器的制造商固定的。为增加施加于冷冻保存的材料的功率，因此必须通过增加容器的外表面温度、减小内表面温度或者这些方法的一些组合来增加跨容器壁的温度梯度（dT）。

当通过一些构件将容器壁维持在固定温度下时，所得的解冻曲线通常包含暖化期间的三个截然不同的阶段。图6中针对在20°C的壁温下10%wt的甘油溶液系统的情况示出了该情况。暖化的三个截然不同的阶段如下：

I. 固体热传导：当样品被维持在其玻璃转变温度（对于10%的甘油溶液而言为近似-45°C）下时，系统中不存在自由液体。通过容器壁发生进入冰的固体内的能量传递。在该布置中，冰初始地极冷，且因此dT项是大的。高热功率将流入系统内，且样品将快速暖化。当样品暖化且至容器壁的温度梯度减小时，暖化的速率（被施加于系统的功率）贯穿该体系（regime）指数地衰减。