[发明专利]聚合酶组合物和制造与使用其的方法

权利要求书

1.一种包含经过修饰的聚合酶多肽的组合物，所述多肽由SEQ ID NO:1经修饰后的氨基酸序列组成，其中所述经过修饰的聚合酶多肽展现聚合酶活性并且相对于SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:34的参考聚合酶展现在热稳定性中的改进，其中对SEQ ID NO:1进行i)或ii)或iii)的修饰：

i)选自E397V、G418C、E745T和E805I的单一氨基酸取代；或

ii)双重氨基酸取代E397V/E805I，或双重氨基酸取代E397V/E745T；或

iii)三重氨基酸取代E397V/E745T/L763F。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述经过修饰的聚合酶多肽具有在95℃下持续6分钟时改进的热稳定性，所述改进是与SEQ ID NO:34在95℃下持续6分钟时的热稳定性相比。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述经过修饰的聚合酶多肽具有单一氨基酸取代G418C。

4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述经过修饰的聚合酶多肽具有单一氨基酸取代E397V。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述经过修饰的聚合酶多肽进一步包括选自E745T或E805I的一个或多个氨基酸取代，其中编号是相对于SEQ ID NO:1。

6.根据权利要求3或4所述的组合物，其中所述多肽还包括在测序特性中的改进，当所述多肽用于测序工作流的乳液PCR模板扩增步骤中时，所述测序特性选自读取长度、精确度、链偏差性、系统误差和总测序通量，其中所述测序特性使用包含125mM KCl的乳液PCR模板扩增反应来加以分析以产生核酸模板，并且其中所述核酸模板的核酸序列使用高通量测序系统来加以分析。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中由所述经过修饰的聚合酶多肽所展现的所述一种或多种特性包含选自以下的至少两种测序特性：增加的AQ20平均读取长度读数、降低的链偏差性、增加的碱基覆盖度、增加的精确度、增加的测序通量(Mb)和增加的覆盖均匀性，其都相对于具有以下序列的参考聚合酶：SEQ ID NO:34和/或SEQ ID NO:1。

8.根据权利要求4所述的组合物，其中由所述经过修饰的聚合酶多肽所展现的所述一种或多种特性包含增加的AQ20平均读取长度读数、降低的链偏差性、增加的碱基覆盖度、增加的精确度、增加的测序通量(Mb)和增加的覆盖均匀性，其都相对于具有以下序列的参考聚合酶：SEQ ID NO:34和/或SEQ ID NO:1。

9.根据权利要求3或4所述的组合物，其中所述一种或多种特性通过对由GC含量为65％的模板构成的库进行乳液PCR模板扩增反应来加以分析。

10.一种用于使核酸扩增的方法，其包含使所述核酸与经过修饰的聚合酶在适合于使所述核酸扩增的条件下接触，和使所述核酸扩增，其中所述经过修饰的聚合酶由SEQ IDNO:1经修饰后的氨基酸序列组成，其中所述经过修饰的聚合酶展现聚合酶活性并且相对于SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:34的参考聚合酶展现在热稳定性中的改进，其中对SEQ IDNO:1进行i)或ii)的修饰：

i)选自E397V、G418C、E745T和E805I的单一氨基酸取代；或

ii)双重氨基酸取代E397V/E805I，或双重氨基酸取代E397V/E745T。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述经过修饰的聚合酶具有在95℃下持续6分钟时改进的热稳定性，所述改进是与SEQ ID NO:1在95℃下持续6分钟时的热稳定性相比。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述经过修饰的聚合酶具有单一氨基酸取代G418C。