[发明专利]用于利用寡核苷酸编辑细胞中核酸的组合物和方法

说明书

相关申请的交叉引用

以下申请要求临时专利申请系列号62/252,693(2015年11月9日提交)、62/180,175(2015年6月16日提交)、62/141,077(2015年3月31日提交)和62/091,027(2014年12月12日提交)的优先权。

关于联邦资助的研究或开发的声明

不适用

对于联合研究协议的缔约方的名称

不适用

在光盘上提交的材料的引用并入

不适用

技术领域

本发明涉及修饰基因组或RNA的序列的寡核苷酸应用于人和动物治疗(包括体内和体外治疗应用)、美容程序(美容手术，cosmetic procedure)、临床前开发、基础研究和用于农业以提高食品储备、改良动物品种的畜牧业(农场动物和其他驯养动物)以提供理想的特征以及能源生产的领域中的用途。

背景技术

寡核苷酸化学和体内核酸递送技术在过去十年的发展已经开启了DNA和RNA修饰疗法的潜力。许多临床试验中的阳性数据和美国首例系统性反义药物Mipomersen(Isis Pharmaceuticals，San Diego，CA)的批准已进一步证明了寡核苷酸药物的临床应用。

虽然已经证明使用治疗性寡核苷酸通过调节RNA水平抑制蛋白质表达的临床益处，但是核酸编辑或修复方法的临床潜力可能会超过这些抑制方法的临床潜力(T.M.Woolf,等人,PNAS Vol.92:8298-8302,1995和T.M.Woolf,Nat.Biotech Vol.16:341-344,1998)。稳健的编辑技术平台能够实现突变DNA的位点特异性化学校正，保护性等位基因的产生或以其他方式产生针对研究、治疗、美容或农业目的所期望的在整个生物体、细胞或组织的基因组中的变化。这种平台作为对由基因点突变和其他基因病变引起的广泛疾病的治疗性干预以及潜在疗法将具有广泛应用。

有两种常规的用核酸的序列编辑机制。这些机制是化学修饰和将核酸序列掺入靶。通过化学修饰机制，编辑寡核苷酸引起被靶向的核苷酸的化学修饰，使得被靶向的核苷酸的编码改变。第二种常规机制是将一种或多种寡核苷酸掺入靶RNA或DNA序列。在这种机制中，寡核苷酸通常被称为“供体”DNA。这种机制被不严格地称为同源重组(HR)或同源性定向修复，但也可以包括其他机制，诸如基因转换、反式剪接或链侵入后引发核酸合成。

由下一代测序(Next Generation Sequencing)和SNP分析推动的关于遗传途径和分子途径的信息的激增已经提供了大量用于治疗性编辑的靶以治疗单基因疾病和多基因疾病。这些疾病的实例包括家族性阿尔茨海默病、高血压、高胆固醇、HIV(通过诱导CCR5突变)、镰状细胞性贫血症、肥胖症、糖尿病、某些形式的肌营养不良和许多先天性代谢缺陷(inborn errors of metabolism)。DNA编辑修复的治疗潜力已经被有前景的数据证明。已经使用工程化的锌指核酸酶(Sangamo Biosciences，Inc.，Richmond，CA)来治疗HIV并且外显子跳读反义吗啉(Sarepta Therapeutics，Inc.，Cambridge，MA)和2'-O-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸(Prosensa，Leiden，The Netherlands)已被用于治疗某些形式的杜氏肌营养不良。此外，用于提高编辑效率的CRISPR/Cas-9基因编辑方法已经产生了许多研究产品和在治疗应用方面的投入。

Woolf等人在脊椎动物模型系统中首次证实了治疗性mRNA编辑(PNAS Vol.92：8298-8302，1995)。在该系统中，杜氏肌营养不良mRNA中的被靶向的终止密码子突变在靶位点处用编辑反义RNA通过双链体形成(duplex formation)来修饰。Woolf等人的工作诱导了限于特异性的编辑。

Montiel等人(PNAS 110(45)：18285-90，2013)证实了囊性纤维化的mRNA修复的相关机制，其中在哺乳动物细胞中实现了20％的校正。虽然这成功地证明了治疗性编辑的原理，但是Montiel的方法并不容易应用于临床应用。其主要原因是Montiel等人的方法需要通过基因治疗、mRNA治疗或其他方法将修饰的基因、mRNA或蛋白质引入细胞。因此，基因治疗和mRNA治疗所公认的所有已知的缺点也与Montiel的治疗编辑方法有关。