[发明专利]用于辅助菌株介导的真菌基因组修饰的组合物和方法有效

专利信息
申请号: 201580076158.X 申请日: 2015-12-16
公开(公告)号: CN107223157B 公开(公告)日: 2021-01-08
发明(设计)人: A·维拉格;M·沃德 申请(专利权)人: 丹尼斯科美国公司
主分类号: C12N15/90 分类号: C12N15/90;C12N15/80;C12N1/15;C12N9/22
代理公司: 北京市中咨律师事务所 11247 代理人: 张莉;黄革生
地址: 美国加利*** 国省代码: 暂无信息
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摘要:
搜索关键词: 用于 辅助 菌株 真菌 基因组 修饰 组合 方法
【说明书】:

提供了采用辅助菌株系统来促进真菌宿主细胞、例如丝状真菌宿主细胞中的遗传改变的组合物和方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年12月16日提交的美国临时申请序列号:62/092,444的优先权,将其以全文通过引用结合在此。

序列表

将按照37C.F.R.§1.52(e)、经由EFS提交的序列表通过引用结合在此。经由EFS提交的序列表文本文件包含于2015年12月11日创建的文件“40692-WO-PCT_2015-579final_ST25.txt”,其大小为100千字节。

背景技术

应用用于真菌基因组修饰的辅助菌株概念的先决条件是通过融合两种不同细胞类型:辅助菌株(HS)和靶菌株(TS),形成异核体的能力。在一些真菌细胞(例如粗糙脉孢菌)中,可以通过简单混合HS和TS的孢子,并且允许它们在选择培养基上一起萌发,来完成这一融合。在其他真菌细胞(例如里氏木霉)中,并不是这么容易地发生细胞融合,并且必需制造原生质体来促进融合。一旦来自HS和TS的细胞融合,共享的细胞质允许HS提供的益处可用于TS。在粗糙脉孢菌中,细胞被连接至合胞体,该合胞体允许细胞质连同细胞器在细胞小室之间进行迁移(Roper,M.Simonin,A.,Hickey,P.C.,Leeder,A.,and Glass,N.L.2013.Nuclear dynamics in fungal chimera.一旦利用了来自异核体的益处,组分菌株需要被分开。这是通过使异核体形成孢子、将单个分生孢子涂板、并且验证源自单个单核孢子的菌株来实现的。在粗糙脉孢菌中,可以在包含碘乙酸的培养基上产生包含单个细胞核的小分生孢子(Ebbole,D.和Sachs,M.S.1990.A rapid and simple method forisolation of Neurospora crassa homokaryons using microconidia.[用于使用小分生孢子分离粗糙脉孢菌同核体的迅速并且简单的方法]Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学通讯]37),同时某些里氏木霉菌株主要具有多核的分生孢子。在里氏木霉中,如果产生多核的分生孢子的菌株不能被产生单核的分生孢子的菌株取代,则需要进行另外的轮的孢子纯化,从而延长该程序。

作为这些差异和其他差异的结果,仍未将辅助菌株概念并入用于里氏木霉中的常规操纵和菌株改进的方法中。

因此,仍然存在对于开发用于多种真菌宿主细胞(包括里氏木霉)的有效率的并且有效的辅助菌株介导的基因组工程化方法和组合物的需求。

发明内容

提供了采用辅助菌株系统来促进真菌宿主细胞、例如丝状真菌宿主细胞中的遗传改变的组合物和方法。

本披露的方面在于用于供体DNA与真菌细胞,例如丝状真菌细胞中的基因组座位的同源重组的组合物和方法。

因此,本披露的方面包括用于供体DNA与真菌细胞中的基因组座位的同源重组的方法,该方法包括:(a)产生辅助真菌菌株和靶真菌菌株之间的异核体,其中该辅助真菌菌株包含使非同源末端连接(NHEJ)机制沉默的表达构建体;(b)将供体DNA引入该异核体中,其中该供体DNA包含对于在该靶菌株中的基因组座位处的同源重组而言与该基因组座位足够同源的区域;(c)自(b)的异核体细胞产生孢子并且接种这些孢子;并且(d)鉴定来自接种的孢子的细胞,在所述细胞中(i)已经通过在基因组座位的同源重组将供体DNA整合进基因组中,以及(ii)不存在使非同源末端连接(NHEJ)机制沉默的表达构建体。

在某些实施例中,表达构建体使以下项中的一个或多个沉默:ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4、和xrs。在某些实施例中,表达构建体使ku80、ku70、或二者沉默。

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