[发明专利]一种用于机械和水动力微流体转染的方法以及用于其的设备

说明书

发明领域

本发明涉及一种用于将外源性物质引入细胞中的方法，所述方法包括使所述细胞在所述外源性物质存在下暴露于瞬时压力降低。瞬时压力降低优选与其中存在细胞和外源性物质的液体的不稳定流联接。具体地说，本发明涉及哺乳动物细胞的转染。

相关申请

本申请要求2015年1月7日提交的名称为“Continuous Delivery Technique”的澳大利亚临时申请号2015900021的优先权，所述临时申请的主题以引用的方式整体并入本文。

发明背景

贯穿本说明书对现有技术的任何讨论决不应被视为承认所述现有技术是广泛已知的或形成本领域中的公知常识的一部分。

在体外和体内将诸如小有机分子、蛋白质和核酸的外源性物质引入细胞中对于疗法的研究和开发以及治疗剂递送策略的进展是至关重要的。

例如，将荧光标记的蛋白质引入细胞中允许对遍及所述细胞的蛋白质的运输的实时分析，这还可有助于在疾病的临床重要阶段期间或者响应于特定触发物鉴别蛋白质相互作用。在药物开发过程中将天然不能有效穿过细胞膜的推定小有机分子药物引入细胞中可在将宝贵的时间和精力转向开发用于这些药物的递送媒介物之前提供关于所述药物的活性的信息。

将核酸引入细胞中是细胞疗法制造中的关键步骤，其中将编码基因的表达载体穿过细胞膜递送至细胞质中以有效地工程化可用作治疗剂的活细胞。例如，细胞疗法可用于诱导个体的自身免疫系统来攻击癌细胞或逃避病毒如HIV。鉴于癌症和HIV在人群中的流行，其中在2013年估计有3500万HIV患者并且在2012年估计及有1400万新癌症病例，所以从全球健康的角度来看癌症和HIV具有特定相关性。利用细胞源性的基因疗法作为全球健康战略的一部分需要一种细胞疗法制造方法，所述方法能够可重复地产生足够数量的产品，以在适当的价格点且在根据监管标准的当前良好生产规范下每年潜在治疗数千万患者。

因此，以快速和有效的方式将外源性物质且具体地说核酸引入细胞中的能力既是有价值的研究工具，也是治疗策略的有用组成部分。

存在几种已知的用于将试剂引入细胞中的方法，其中方法的选择通常由细胞的类型、所需的效率水平、所引入的分子的大小和可用的细胞数量决定。

虽然术语可互换使用，但是将诸如核酸的试剂引入真核细胞中通常被称为“转染”，而将核酸引入原核细胞中通常被称为“转化”。转染和转化方法可方便地分为三类，即化学方法、物理方法和基于病毒的方法。

转染的化学方法采用诸如阳离子脂质、磷酸钙、阳离子聚合物和树枝状聚合物分子的试剂来基本上包装用于递送至细胞中的核酸。然而，许多这些方法并不适用于所有细胞类型。此外，它们可能受到细胞培养基中pH波动或盐/磷酸盐的损害。由于在这些方法中的一些中需要包装核酸，因此可限制可容纳的核酸分子的大小。此外，化学转染方法可能需要使用高浓度的对细胞而言昂贵和/或毒性的试剂，和/或所述方法可能仅实现低/不一致的转染效率。

用于转染真核细胞的常规物理方法包括使用磁性纳米颗粒、电穿孔、生物射弹颗粒递送和显微注射。然而，这些方法对细胞往往是相当苛刻的，通常导致高死亡率。这些方法还可能需要固定化的细胞、昂贵的设备和/或就执行所述方法的人员而言更大程度的技术技能。例如，在一些电穿孔方法中，首先使悬浮细胞透化，随后施加电场以促进带电荷的外源性物质的主动递送。因此这些技术需要专门的设备和消耗品来透化细胞膜并施加电场。

基于病毒的转染方法依赖于病毒载体，包括用于将核酸递送至细胞中的慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体，其中所述核酸可通过病毒启动子以高水平表达。预期这些基于病毒的方法被证明适用于有效治疗淋巴癌和造血系统癌症并且适用于HIV治疗剂。然而，由于可变的转染效率，制造用于这些类型的治疗剂的病毒载体的成本是每个患者大约数千美元。此外，如果所述方法不是自动化的，则所述方法可能既是劳动密集型的又容易出现制造问题。

将外源性物质且具体地说核酸引入原核细胞中也是在治疗药物开发和实际上(通常)研究期间生物制剂的制造的重要方面。可通过包括化学转化和电穿孔的各种方法实现用外源核酸转化细菌细胞系以用于重组产生有价值的分子如基于生物制剂的药物(所谓的生物药剂)。然而，这些方法可能需要在转化之前使细胞处于“感受态”(例如，通过诱导开启一组基因的高细胞密度和/或营养限制)，它们可能不适用于所有细胞类型和/或它们可能导致高水平的细胞死亡率。