[发明专利]在大肠杆菌中进行有效基因编辑的组合物和方法

权利要求书

1.一种用于编辑大肠杆菌细胞的基因组中的核苷酸序列的方法，所述方法包括将包含编码引导RNA的DNA序列的至少一个重组DNA构建体和环状多核苷酸修饰模板提供给包含可操作地连接至诱导型启动子的Cas9内切核酸酶DNA序列的大肠杆菌细胞，其中所述Cas9内切核酸酶DNA序列编码能够在所述大肠杆菌细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas9内切核酸酶，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰，其中所述至少一个核苷酸修饰选自(i)至少一个核苷酸的替代，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，或(iv) (i)-(iii)的任何组合。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞的基因组中的核苷酸序列选自：启动子序列、终止子序列、调节元件序列、编码序列、原噬菌体、假基因、和外源基因。

3.如权利要求1所述的方法，其中经由环状质粒提供包含编码引导RNA的DNA序列的所述重组DNA构建体。

4.如权利要求1所述的方法，其中在分开的质粒上各自提供所述重组DNA构建体和所述环状多核苷酸修饰模板。

5.如权利要求1所述的方法，其中在单个质粒上提供所述重组DNA构建体和所述环状多核苷酸修饰模板。

6.如权利要求1所述的方法，其中经由选自以下的一种手段提供所述重组DNA构建体和所述环状多核苷酸模板：电穿孔、热休克、噬菌体递送、配对、接合和转导。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述靶位点的侧翼是第一基因组区域和第二基因组区域，其中所述环状多核苷酸模板进一步包含与所述第一基因组区域同源的第一区域和与所述第二基因组区域同源的第二区域。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞不表达外源重组酶蛋白。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述大肠杆菌细胞不表达选自以下的蛋白：RecET蛋白、λ-red蛋白、和RecBCD抑制剂。

10.如权利要求1所述的方法，其进一步包括从所述大肠杆菌细胞生长子代细胞，其中所述子代细胞包含所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述靶位点位于大肠杆菌galK基因中。

12.一种通过如权利要求1所述的方法产生的大肠杆菌细胞，其中所述大肠杆菌细胞不表达外源重组酶蛋白。

13.如权利要求12所述的大肠杆菌细胞，其中所述大肠杆菌细胞不表达选自以下的蛋白：RecET蛋白、λ-red蛋白、和RecBCD抑制剂。

14.一种从如权利要求12或13所述的大肠杆菌细胞产生的大肠杆菌菌株。

15.一种用于产生galK突变的大肠杆菌细胞的方法，所述方法包括：

a)将包含编码引导RNA的DNA序列的至少一个环状重组DNA构建体和至少一个环状多核苷酸修饰模板提供给包含可操作地连接至诱导型启动子的Cas9内切核酸酶DNA序列的大肠杆菌细胞，其中所述Cas9内切核酸酶DNA序列编码能够在大肠杆菌基因组中的galK基因组序列内的靶位点处引入双链断裂的Cas9内切核酸酶，其中所述环状多核苷酸修饰模板包含所述galK基因组序列的至少一个核苷酸修饰；

b) 从 (a) 的大肠杆菌细胞生长子代细胞；并且，

c) 针对所述至少一个核苷酸修饰的存在，评估 (b) 的子代细胞。