[发明专利]转分化的方法和其使用方法

权利要求书

1.一种制造人类胰岛素产生细胞的群体的体外方法，所述方法包括以下步骤：

（a）处理成人肝组织以回收原代成人肝细胞；

（b）使所述原代成人肝细胞繁殖和扩增到预定的细胞数；

（c）将所述扩增的细胞转分化，其中所述转分化包含：

（1）用至少一种表达载体感染所述扩增的细胞，所述感染发生在第一时间段，

（i）其中所述至少一种表达载体包括含有编码PDX-1多肽的核酸的腺病毒载体，以及含有编码人类第二胰腺转录因子多肽的核酸的腺病毒载体，其中使用所述腺病毒载体的所述感染发生在同一时间；

或

（ii）其中所述至少一种表达载体包括含有编码人类PDX-1多肽和第二胰腺转录因子多肽的核酸的腺病毒载体；

以及

（2）用包含编码MafA多肽的核酸的腺病毒载体感染（1）的所述扩增的受感染的细胞，所述感染发生在第二时间段；以及其中所述第二时间段在所述第一时间段之后；以及

（d）收获所述转分化的扩增的细胞；

从而制造所述人类胰岛素产生细胞的群体，其中所述成人肝细胞表达间充质干细胞标志物并且不经历其中所述细胞包含胚胎特征的阶段，

其中所述人类胰岛素产生细胞的群体具有

与对照非转分化原代成人肝细胞相比，增加的胰岛素含量，或增加的葡萄糖调节的胰岛素分泌，或增加的葡萄糖调节的C肽分泌，或增加的内源Nkx6.1转录因子的表达，或其任何组合，

其中所述胰岛素产生细胞表达间充质干细胞标志物且不包含胚胎特征，并且

其中所述第二胰腺转录因子选自NeuroD1和Pax4。

2. 权利要求1所述的方法，其中所述繁殖和扩增包含使用生物反应器。

3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的所述人肝组织包含

从患有胰腺病症或胰岛素依赖性糖尿病的受试者获取的肝组织。

4. 如权利要求2所述的方法，

a. 其中所述生物反应器包含单个生物反应器或多个生物反应器；或

b. 其中所述生物反应器包含单次使用生物反应器、多次使用生物反应器、封闭系统生物反应器、或开放系统生物反应器、或其任意组合；

或其任意组合。

5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其中在步骤（c）中，所述扩增的细胞的所述转分化包括经由一系列生物反应器系统进行转分化。

6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，还包括富集所述原代成人肝细胞中倾向于转分化的细胞的步骤，其中所述富集步骤在所述转分化步骤之前或与所述转分化步骤同时进行，或两者都有。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述原代成人肝细胞中倾向于转分化的细胞包含以下细胞：

（a）含有活性Wnt信号转导通路；

（b）具有激活谷氨酰胺合成酶响应元件的能力；

（c）当所述细胞包含肝细胞时，具有增加的HOMER1、LAMP3、BMPR2、ITGA6、DCBLD2、THBS1、或VAMP4、或其任意组合的表达；

（d）当所述细胞包含肝细胞时，具有降低的ABCB1、ITGA4、ABCB4、或PRNP、或其任意组合的表达；或

其任何组合。

8.如权利要求1-4中任一项所述的方法，还包括在所述原代细胞中增加Wnt信号激活的步骤。

9.如权利要求1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述原代成人肝细胞与锂一起孵育。

10.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述预定的细胞数为10-20亿个细胞。

11.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中间充质干细胞标志物包括CD73、或CD90、或CD105、或CD44，或其任意组合。