[发明专利]用于高效生产生物燃料和/或生物质的方法和组合物

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年1月28日提交的美国临时专利申请号62/108,917，以及2015年11月23日提交的美国临时专利申请号62/258,785的优先权。无需声明，上述公开的每一项的全部内容通过引用被具体地并入本文。

技术领域

本发明通常涉及遗传工程的领域。更具体的，其涉及制备和使用工程化的细胞从而获得生物燃料和/或生物质，尤其是细胞内生物产物。

发明背景

通常需要细胞破碎以从细胞(例如细菌)中回收细胞内产物从而释放细胞内产物以用于进一步的分离过程。已经使用的细胞破碎方法包括珠磨法、高压均化器、高压灭菌、超声处理、超临界CO2萃取、酶催化细胞壁降解以及加入盐酸、氢氧化钠或碱裂解。所有这些过程在大规模时都成本昂贵(例如，提取1加仑海藻油需要约$1.75)。以通过向细胞中加入外加酶的酶消化为例，酶的高成本源于它们的生产以及在它们使用之后酶通常不能被回收和循环利用的事实。

发明内容

本公开涉及与微生物相关的方法和组合物以及它们在制造有价值资源中的应用。具体的，所述微生物在制造生物燃料、生物质和细胞内生物产物中有价值。虽然不限于作为生物质使用，但是作为生物质使用微生物细胞的能力是有利的，尤其是在最小化从微生物细胞中生产细胞内产物的成本的条件下微生物能够被控制的情况。组合物包括具有编码蛋白酶的非天然核酸的细胞，所述蛋白酶在某些条件下比在其他条件下要更加有活力。在特定的实施方案中，蛋白酶在高温条件，例如在高于50℃的温度下，保持活力。

在一些实施方案中，存在包括一种或者多种重组和/或工程化的微生物细胞的组合物，所述重组和/或工程化的微生物细胞可包括编码热稳定性蛋白酶的异源核酸片段。在某些实施方案中，热稳定性蛋白酶在46℃到60℃之间，或者在48℃到55℃之间的温度时具有蛋白酶活力。

在特定的实施方案中，所述异源核酸片段整合到微生物的基因组或者染色体中，这意味着它通过共价键与微生物的基因组连接。典型的共价键将通过核苷酸之间的磷酸二酯键。在某些实施方案中，所述核酸片段将整合到细胞的细胞核基因组中，尽管它有可能整合到线粒体基因组中。在其他实施方案中，所述异源核酸片段不被整合到基因组中，在这种情况下，其在细胞染色体外，例如在质粒上。在某些情况下，所述异源核酸片段整合到微生物基因组的随机位置中，然而在其他实施方案中，其整合到基因组的计划的位置或者指定的位置中。在一些实施方案中，所述异源核酸片段整合到基因组的编码蛋白酶的位置或者不编码基本的或者管家基因或者其他编码序列的位置中。在一些实施方案中，对于所要求保护的发明，可以排除任何整合方法和/位置。

在某些实施方案中，所述热稳定性蛋白酶是基于其利用的催化残基的六大类蛋白酶：丝氨酸型蛋白酶(利用丝氨酸醇)；苏氨酸蛋白酶(利用苏氨酸二级醇)；半胱氨酸蛋白酶(利用半胱氨酸硫醇)；天冬氨酸蛋白酶(利用天门冬氨酸羧酸)；谷氨酸蛋白酶(利用谷氨酸羧酸)，以及，金属蛋白酶(利用金属，通常是锌)中的一种。在具体的实施方案中，所述热稳定性蛋白酶不是噬菌体热稳定性蛋白酶。在特定的实施方案中，所述热稳定性蛋白酶来源于细菌。在其他实施方案中，所述热稳定性蛋白酶来源于真菌，例如来源于酵母。在某些实施方案中，所述热稳定性蛋白酶来源于嗜热生物，其是指在相对高的温度，例如在41℃和122℃之间生长的生物。在某些实施例中，热稳定性蛋白酶来源于嗜热菌例如真细菌。在一些实施方案中，对于所要求保护的发明，可以排除本文公开的任何一种蛋白酶。