[发明专利]通过用内切H共表达的体内N-去糖基化重组蛋白质的生产

说明书

植物已经成为一种替代的表达系统，并且越来越多地被工业和学术界用于生产靶蛋白。然而，植物使蛋白质糖基化的能力对于那些不需要N‑糖基化的蛋白质可能是显著的限制。例如，恶性疟原虫蛋白或人类因子XIII的A链不携带N‑连接的聚糖，或炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)不是糖蛋白；然而，这些蛋白质含有潜在的N‑连接的糖基化位点，其可能在酵母菌、哺乳动物或植物系统中的表达期间异常地被糖基化，由于表位的不正确/变异的折叠和/或掩蔽，可能导致降低的功能性和免疫原性。为了克服这个问题，我们最近通过使用植物中的瞬时表达与细菌PNGase F(肽：N‑糖苷酶F)共表达开发了体内蛋白质的酶促去糖基化的策略(WIPO专利申请WO/2012/170678)，这允许生产可提供高传播阻断(TB)活性的疟疾疫苗候选物Pfs48/45(Mamedov等人，2012)。此外，与糖基化的形式相比，其他去糖基化的抗原在小鼠中诱导了显著更高水平的毒素‑中和抗体应答(Mamedov等人，原稿已提交)。尽管PNGase F处理(体内去糖基化)完整地除去寡糖，但由于NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺(N)脱酰胺成天冬氨酸(D)，导致去糖基化的蛋白中的氨基酸改变。在这项研究中，开发了一种策略，用于在植物中生产以非N‑糖基化形式的靶蛋白，但是所得到的去糖基化的蛋白质的NxS/T位点没有氨基酸改变，这可以提高具有天然样折叠的植物或其他真核系统中的非N‑糖基化重组蛋白质的生产。因此，本发明描述了使用瞬时表达系统、通过在植物中与内切‑β‑N‑乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H)共表达，用于重组N‑糖基化蛋白质的体内去糖基化的材料和方法。还提供了在植物中表达活性内切H的方法。

技术领域

该文本涉及用于在植物中生产以非N-糖基化形式的感兴趣的重组蛋白的材料和方法。开发了用于在植物中生产以非N-糖基化形式的靶蛋白的策略，但是在得到的去糖基化蛋白质的NxS/T位点没有氨基酸改变，这可以提供具有天然样折叠的植物或其他真核表达系统中的非N-糖基化重组蛋白的生产。描述了使用瞬时表达系统、通过与植物中的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H)共表达，用于重组N-糖基化蛋白质的体内去糖基化的材料和方法。还提供了表达植物中的活性内切H的方法。

发明内容

植物已经成为一种替代的表达系统，并且越来越多地被工业和学术界用于生产靶蛋白。然而，植物使蛋白质糖基化的能力对于那些不需要N-糖基化的蛋白质可能是显著的限制。例如，恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)蛋白或人类因子XIII的A链不携带N-连接的聚糖，或炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的保护性抗原(PA)不是糖蛋白；然而，这些蛋白质含有潜在的N-连接的糖基化位点，其可能在酵母菌、哺乳动物或植物系统中的表达期间异常地被糖基化，由于表位的不正确/变异的折叠和/或掩蔽，这可能导致降低的功能性和免疫原性。为了克服这个问题，我们最近通过使用植物中的瞬时表达与细菌PNGaseF(肽：N-糖苷酶F)共表达开发了体内蛋白质的酶促去糖基化的策略(WIPO专利申请WO/2012/170678)，这允许生产可提供高传播阻断(TB)活性的疟疾疫苗候选物Pfs48/45(Mamedov等人，2012)。此外，与糖基化的形式相比，其他去糖基化的抗原在小鼠中诱导了显著更高水平的毒素-中和抗体应答(Mamedov等人，原稿已提交)。尽管PNGase F处理(体内去糖基化)完整地除去寡糖，但由于NxS/T位点(序列)中的天冬酰胺(N)脱酰胺成为天冬氨酸(D)，导致去糖基化的蛋白质中的氨基酸改变。在这项研究中，开发了一种策略，用于在植物中生产以非N-糖基化形式的靶蛋白，但是在得到的去糖基化蛋白质的NxS/T位点没有氨基酸改变，这可以提供具有天然样折叠的植物或其他真核系统中的非N-糖基化重组蛋白质的生产。因此，本发明描述了使用瞬时表达系统、通过在植物中与内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(内切H)共表达，用于重组N-糖基化蛋白质的体内去糖基化的材料和方法。还提供了在植物中表达活性内切H的方法。

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