[发明专利]以血红蛋白类载氧体为基础的无基质人脐带血红蛋白的制备

说明书

(一)技术领域

本发明涉及利用Q300阴离子交换层析的方法对对人脐带血血红蛋白的分离纯化，利用SDS-PAGE、HPLC、氧合度测定等方法检测纯化效果，最终制备出了一种安全的以血红蛋白类载氧体的无基质人脐带血血红蛋白。

(二)背景技术

输血一直是战争、疾病、自然灾害以及外科手术中重要的治疗手段。尤其是在某些紧急的情况下，如外科手术、失血性休克、体外循环、机体缺血和再灌注、器官保存和血液中病毒性疾病，其作用显得尤为重要且无可替代。但是基于我国人口众多、人口的老龄化的基本国情，以及外科手术在数量和复杂程度方面的不断增加，而献血人员严重不足，导致血液供给量日益突出。特别是当遇到地震、台风等意外自然灾害时，血液的需求量也因此大大增加。在实际应用总是存在各种问题，如(1)血液的来源不足，有效的保存时期短；(2)输血前的准备工作烦琐费时，包括严格的血型鉴定和交叉配型；(3)输血过程中可能存在传染性疾病传播隐患，如乙型、丙型肝炎和HIV等。因此需要开发出一种具有携带O₂功能，并根据体内氧分压的高低进行可逆地结合与分离O₂，替代人体血液的溶液。应对这些问题，使得血液代用品的研究开始逐步展开。

优良的血液代用品应具有以下特点：(1)可以有效地进行O₂和CO₂交换；(2)在体内半衰期时间足够长；(3)容易代谢和排出体外，且对人体组织及各脏器功能无损害；(4)渗透压和黏度适宜，能够在血管中进行正常的流动与输送氧气；(5)没有免疫源性，方便在临床试验前进行消毒和灭菌处理；(6)产品稳定性强，能够用于大规模工业生产；(7)室温下保持稳定，能够长期保存。血红蛋白的一个重要功能就是在机体内携带和运输氧气，维持机体正常的生理代谢。因此以血红蛋白作为原料的血红蛋白类载氧体(hemoglobin-based oxygen carriers，HBOCs)是一种安全有效且可实现的载氧方式。

然而，由于血红蛋白的纯度不够，受杂蛋白的影响在血液的再灌注中将对人体的肾，肝，脑产生毒性；影响心血管活性及其他一些免疫疾病。因此，血红蛋白的纯度将直接影响以无基质血红蛋白为基础的血液代用品的质量安全。无基质血红蛋白溶液的纯度必须达到99％，且必须严格高铁血红蛋白的含量。基于这些要求，大量的分离纯化研究均未能达到理想的要求。就血源来讲，因人脐带血具备2，3-DPG别构调节作用，所以我们选则人脐带血作为原料 来进行分离纯化工作。

随着以血红蛋白(Hb)为基础的载氧体(Hemoglobin Based Oxygen Carriers，HBOCs)的血液代用品的研究不断深化并逐步实现产业化，使得人们对Hb的需求量也大大增加。这对作为重要原料的血红蛋白(Hb)的纯度和质量提出了更高的要求，其质量将直接影响血红蛋白类血液代用品的好坏与否。衡量血液代用品的重要指标包括：(1)Hb的纯度，Hb的纯度将直接决定血代品的质量。如若Hb的纯度不高，其中有杂蛋白的影响，在血液的再灌注中将对人体的肾，肝，脑产生毒性；影响心血管活性及其他一些免疫疾病；(2)高铁血红蛋白含量，高铁血红蛋白的含量高低将直接决定血红蛋白是否具有载氧能力。Hb是有4个亚基和4个卟啉环的复杂蛋白质，在脱离红细胞后容易解聚成为αβ二聚体，同时卟啉环中的二价铁容易氧化成三价铁，使Hb变为无载氧活性的MetHb；(3)氧结合能力，制品的氧结合力有多强，才能有效的向组织供氧。现在进入临床的制品，其氧结合力多与红细胞中的血红蛋白相近(P₅₀值约为26mmHg)。

通常文献中介绍的血红蛋白的分离纯化主要包括4个步骤：血液的前处理；粗提；分离纯化；纯度鉴定。首先用生理盐水或四氯化碳洗涤压积红细胞释放血红蛋白分子，离心收集血红蛋白溶液；其次通过过滤或离心除去小分子杂志和残留的细胞膜；然后通过高效液相法后凝胶柱层析法等手段去除磷脂及其他杂蛋白；最后对纯化样品进行纯度检测。