[发明专利]一种结核分枝杆菌T细胞抗原表位多肽及其应用

说明书

本发明属生物医学检验领域，具体涉及一种检测结核分枝杆菌感染的试剂、方法及应用。本发明通过筛选结核分枝杆菌特异性的T细胞抗原表位，公开了一种结核杆菌检测试剂，其含有SEQ ID NO.1所代表的多肽PP4。本方法是用单个多肽PP4或PP4和T‑SPOT.TB试验（Oxford Immunotec,Oxford,UK）所用CE多肽的组合与感染结核杆菌个体的T细胞相接触，检测从T细胞释放的细胞因子。它能够有效地检测活动性结核或潜伏性结核感染，同时它不受接种BCG疫苗的干扰。该技术具有检测灵敏度高、特异性高、速度快和操作简单的特点，可用于肺结核、肺外结核诊断以及潜伏感染的辅助诊断。

技术领域

本发明涉及结核分枝杆菌特异性抗原表位多肽，特别是抗原RD13区的T细胞抗原表位多肽。

背景技术

结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病，全球目前有近三分之一的人感染结核分枝杆菌，因结核病死亡人数每年达13万，超过其它传染病死亡人数的总和。

结核病的早期诊断对于控制患者疾病进展和疾病的传播具有重要意义。目前，结核病临床诊断仍然缺乏高灵敏度和高特异性的手段。传统的结核菌素皮试(TST/PPD)所用的抗原结核菌素因为能够跟卡介苗(BCG)接种产生交叉反应使得其产生较高比例的假阳性，而临床诊断的“金标准”——结核分枝杆菌培养，则有时间长，阳性率低等缺陷。另外，基于X射线透射和临床表现的诊断则特异性较低，容易与其他肺部感染或疾病相混淆。

随着近年来我国HIV感染率的快速上升，肺外结核(EPTB)以及结核/HIV合并感染发病率亦呈上升趋势。EPTB以及结核/HIV合并感染时，由于其结核病菌载量相对于活动性肺结核小，且累及部位不易取样，因而诊断更为困难。此外结核/HIV合并感染者由于免疫功能缺陷，因而常规的免疫学结核检测手段，如结核菌素皮试(TST/PPD)常常出现假阴性。

特异性抗原诊断一直是确认病原体感染及评估状况较为可靠的方法，且有早期诊断价值。由于人体在对抗结核分枝杆菌的感染中，细胞介导的免疫反应起到了关键性的作用，所以寻找结核杆菌特异性的T细胞抗原和检测T细胞免疫反应成为近年来研究热点。BCG基因组中的某些片段相对于牛型结核分枝杆菌或结核分枝杆菌H37Rv来说发生缺失，这些缺失片段被定义为RD区(Region of Deletion,RD)。一种以T细胞为基础的γ-干扰素释放试验(Interferon-γRelease Assay,IGRAs)得到较为广泛的应用，其原理是受到结核分枝杆菌特异性RD区抗原刺激而致敏的T细胞，再次遇到同类抗原时能产生γ-干扰素，对全血或分离的外周血单核细胞在结核分枝杆菌特异性抗原刺激后产生的γ-干扰素进行检测，就可以反映机体是否存在潜伏性的结核感染。目前获得商品化应用的IGRAs主要有2种方法，一种称为QuantiFERON(QFT)-TB GOLD试验(Cellestis,Victoria,Australia)，另一种称为T-SPOT.TB试验(Oxford Immunotec,Oxford,UK)。这两种检测方法所采用的结核分枝杆菌特异性的抗原为ESAT-6(early secreted antigenic target 6)和CFP-10(culturefiltrate protein 10),其编码基因位于RD1(Region of Difference 1)区，RD1在BCG和绝大多数非结核分枝杆菌的基因组中是缺失的，理论上可以避免上述在TST中影响特异性的PPD交叉抗原反应，能够较好地区分真性结核感染和BCG接种诱导的反应。

但上述ESAT-6、CFP-10抗原属于结核杆菌早期分泌蛋白，主要在结核杆菌的快速生长期分泌，而在结核持续感染中分泌量减少，导致检测的敏感性不足，局限了该试剂的推广。另有研究显示上述两种IGRAs试剂在发展中国家的效果并不理想，推测可能与发展中国家非结核分枝杆菌的感染率较高有关。此外该两种IGRAs试剂价格昂贵，在发展中国家难以得到广泛应用。