[发明专利]一种肿瘤抑制蛋白变体DV451及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及肿瘤抑制蛋白变体。

背景技术

肿瘤相关蛋白DENND2D-v2，由468个氨基酸残基组成，自序列4的氨基末端第47至 145位氨基酸残基为uDENN结构域，自序列4的氨基末端第146至330位氨基酸残基为DENN结 构域，自序列4的氨基末端第368至435位氨基酸残基为dDENN结构域。该肿瘤相关蛋白在小 鼠成纤维细胞内稳定高表达可以明显抑制该细胞的恶性转化；在mRNA水平检测其在细胞系 中的表达结果表明，肺癌细胞系中的表达水平显著低于原代培养的正常支气管上皮细胞； 在肺癌临床组织标本中检测其表达水平结果表明，肺癌组织的表达水平明显低于其周边的 正常组织。该肿瘤相关蛋白可用于肿瘤的体外诊断、预后。含有上述肿瘤相关蛋白编码基因 的重组真核表达载体在导入肺癌细胞系中后，能单独引起肺癌细胞系的生长变缓及致瘤性 减弱。因此，该蛋白具有较好的肿瘤药物应用前景。

在现有技术中，为了提高蛋白的活性，针对蛋白的活性位点进行特异性的突变和 取代，从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该蛋白的生物活性，申请人 通过大量的实验，针对DENND2D-v2氨基酸序列中特定的位点进行了点突变，从而获得了比 DENND2D-v2蛋白本身具有更高抑制活性的变体。

发明内容

本发明涉及亲本蛋白的分离的变体，其在至少一个对应于SEQIDNO:1的成熟多 肽的位置53Y、60K、70P、79R、92R、97I、109A、131K、141A、204S、225E、232L、253K、270A、271A、 297C、305G、322V、347L、379F、398Q、433Q或451L的位置包含修饰。具体而言，本发明的变体 具有改善的抑制活性。

优选地，应用于本发明的方法、呈现改善的抑制活性的蛋白变体包含至少1种任一 下述修饰：53Y/F、60K/C、70P/V、79R/K、92R/K、97I/F、109A/S、131K/R、141A/P、204S/T、 225E/A、232L/S、253K/V、270A/R、271A/S、297C/R、305G/S、322V/L、347L/R、379F/S、398Q/R、 433Q/S、451L/V。

本发明还涉及产生本发明的蛋白变体的方法，包括(a)培养宿主细胞；和(b)回收 所述蛋白变体。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培 养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下 进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料 分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所 述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据 公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养 基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物 (lysate)回收。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养 培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析 (例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型 (preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如， ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden编,VCHPublishers,NewYork,1989)。

本发明的多肽用于制备相应的药物，去用于治疗癌症。

具体实施方式

实施例1：DENND2D-v2基因的获得

DENND2D-v2：

上游引物5’CACTCCAGGGGCCATGGATG3’

下游引物5’GTCATTCTTATTCACCACAGCTC3’

用上述引物，以人正常肺组织cDNA文库(Clontech：K1420-1)为模板进行PCR扩增 反应，反应条件如下：

反应体积50μl，其中含有：