[发明专利]一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法

说明书

本发明属于细胞培养技术领域，具体是一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法。本发明培养方法中，裸鼹鼠的心肌细胞分离、纯化操作步骤简单，细胞贴壁快、存活率高，细胞培养体系稳定性好，是一种较为理想的裸鼹鼠原代心肌细胞培养方法，基本可以满足医学、生物学、药学和生命科学各研究领域对裸鼹鼠心肌细胞相关实验研究的要求，适宜在一般实验室进行推广应用。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体地说，是一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法。

背景技术

裸鼹鼠(Heterocephalus glaber，Naked mole-rat)是一种极具研究价值的新型实验动物，它具有耐低氧、抗衰老和抗肿瘤等诸多奇特的生物学特性，在老年病学、肿瘤学、免疫学等医学和生命科学研究领域中发挥着重大作用，具有不可替代的地位。尤其是在耐低氧研究方面，为缺氧相关的心血管疾病等研究提供了理想的研究载体和科研工具。心肌细胞是心脏的基本组成单位，是进行生理、药理、病理、毒理及能量代谢等方面研究的主要细胞来源，同时也是心肌组织工程种子细胞的主要来源之一。目前，由于裸鼹鼠动物来源珍贵、稀有，且生物学特性独特，国内尚无针对裸鼹鼠心肌细胞培养方法的研究，这极大地影响和限制了新型实验动物裸鼹鼠在生命科学研究尤其是在心血管疾病研究中的推广应用。因此，亟需开展培养裸鼹鼠心肌细胞的相关技术研究。

中国专利文献CN104087550A公开了一种大鼠心肌细胞的培养方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)将大鼠心肌组织浸于消化酶混合液中进行分次消化至心肌组织松软后弃去消化液，然后加入DMEM培养基，吹打松软的心肌组织，取上清进行离心收获细胞沉淀，所述的消化酶混合液包括0.7～1.0g/L胰蛋白酶和0.5～0.8g/L II型胶原酶；(2)以DMEM培养基重悬步骤(1)所得的细胞沉淀，将细胞悬液过180～220目筛后转移至培养瓶中进行差速贴壁2～3次，每次40～50分钟；(3)取差速贴壁后培养瓶中的细胞悬液，将心肌细胞以1.5～2.5×10⁵个/mL的密度接种于培养容器中，接种后将培养容器置于培养箱中培养；其中，步骤(1)和(2)中所述的DMEM培养基为含8～12％FBS的DMEM培养基，所述的百分比为体积百分比。优选步骤(1)消化在温度为36.5～37.5℃的环境中进行，步骤(2)FBS的浓度为10％，所述细胞悬液过200目筛后转移至培养瓶中进行差速贴壁，差速贴壁的次数为2次，所述差速贴壁的时间为每次45分钟。优选步骤(3)中，培养的条件为将培养容器置于37℃、CO₂浓度为50mL/L的培养箱中培养。

但是关于一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法。该培养方法中，裸鼹鼠的心肌细胞分离、纯化操作步骤简单，细胞贴壁快、存活率高，细胞培养体系稳定性好，是一种较为理想的裸鼹鼠原代心肌细胞培养方法，基本可以满足医学、生物学、药学和生命科学各研究领域对裸鼹鼠心肌细胞相关实验研究的要求，适宜在一般实验室进行推广应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法，包括以下步骤：

(A)向裸鼹鼠心肌组织中加入胰蛋白酶进行消化1-2次，弃去上清液；

(B)在步骤(A)中所得的细胞沉淀中，加入混合消化液，轻轻吹打心肌组织悬液进行消化后，静置；

(C)收集步骤(B)中的上清液，用200目细胞筛过滤后，立即加入等量终止液终止消化，并于冷冻离心机中4℃、1000rpm、离心5min；

(D)步骤(C)中所得的细胞沉淀，依次重复操作步骤B、步骤C两次以上(尽量通过过滤筛筛选消化充分的组织悬液)；