[发明专利]分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法及引物对

说明书

本发明公开了一种快速鉴定小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体基因突变的方法及其专用引物。通过检测烟碱型乙酰胆碱受体α6亚基基因第十二号外显子区域是否发生9个碱基的缺失突变从而判定待测小菜蛾对多杀霉素的抗性，发生了所述的9个碱基的缺失突变的小菜蛾具有对多杀霉素抗性，未发生所述的9个碱基的缺失突变的小菜蛾不具备对多杀霉素抗性。该方法具有快速简便、准确性高的优点，可用于监测小菜蛾田间种群对多杀霉素的抗性等位基因频率和抗药性发生发展动态，为制订小菜蛾化学治理方案提供重要依据，为延缓多杀霉素类杀虫剂抗性发展具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法及引物对。

技术背景

小菜蛾(Plutella xylostella)属于鳞翅目菜蛾科，英文名Diamondback moth，是世界性十字花科蔬菜和油菜害虫，全球每年造成的损失和防治费用高达四五十亿美元。20世纪80年代中后期以来，小菜蛾在我国持续大面积暴发成灾，尤其以华南和西南省份为害严重。据统计，近年来我国蔬菜种植面积接近3亿亩/年，已是世界第一大蔬菜种植和生产国，因小菜蛾为害造成的蔬菜减产和治理费用极其高昂。目前，农业生产上对小菜蛾的防治仍以化学农药为主，由于杀虫药剂的不合理使用及小菜蛾本身的生物学特性，导致其对几乎所有常用杀虫剂均产生了抗性。我国田间小菜蛾种群的抗药性发展速度极快，并导致蔬菜农药残留超标严重威胁农产品质量安全，小菜蛾抗药性治理形势不容乐观。

多杀霉素类化合物(spinosyns)是美国陶氏益农公司在20世纪90年代初期开发的一类天然杀虫产品，属大环内酯类化合物，由土壤放线菌刺糖多孢菌Saccharopolysporaspinosa MertzYao在培养介质中经有氧发酵而得的次级代谢产物，包括20多种活性组分。第一代商业化spinosyns产品多杀霉素(spinosad)首先在美国登记用于作物害虫防治，由spinosyns A(主要成分)和spinosyns D(次要成分)两种化合物混合而成，有很高的生物活性，而且对非靶标生物的毒性很低，对人和其它哺乳动物非常安全。但是，除小菜蛾外，目前已报道包括烟芽夜蛾、家蝇、甜菜夜蛾、果蝇、美洲菊斑潜蝇、棉铃虫和西花蓟马等多个目的田间采集种群和室内选育品系对该药剂产生了较为严重的抗药性。

从现有研究报道来看，只有小部分研究结论表明昆虫对多杀霉素抗性可能与代谢相关，多数研究结果支持靶标抗性机理。Perry等(2007)利用基因敲除技术沉默了果蝇的nAChR Dα6亚基，发现该基因的功能缺失致使果蝇对多杀霉素产生1181倍的抗性，推测在其它物种中nAChRα6的基因突变可能会导致对多杀霉素的抗性。Baxter等(2010)在对多杀霉素极高抗品系(抗性约18,600倍)的研究中取得进展，发现抗多杀霉素小菜蛾nAChR Pxα6亚基存在错误剪接，使该基因在翻译过程中发生提前终止，导致第三跨膜区之后的蛋白缺失。家蝇抗多杀霉素的研究也显示是基于靶标的抗性机理，但通过比较家蝇的nAChR Mdα6亚基抗性和敏感品系该基因选择性剪接、mRNA表达水平及RNA编辑等转录后调控因子，表明nAChR Mdα6基因在家蝇对多杀霉素的抗性形成中未起作用(Gao等，2007a)。并且Mdα5和Mdβ3也没有发现与抗性相关的基因突变(Gao等，2007b)。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中小菜蛾对杀虫剂多杀霉素抗性检测方法灵敏度低、周期长、材料要求高等问题，根据我们对小菜蛾抗多杀霉素的分子机理的研究结果，提供一种分子检测小菜蛾对多杀霉素抗性的方法及引物对。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：