[发明专利]一种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的方法

权利要求书

1.一种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷 的方法，其特征在于，采用高效液相色谱串联二级质谱技术分别检测标准品溶液和经过 预处理的尿液样品中的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，先利用高效液相色谱技术将8- 羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷分离，再利用二级质谱同位素内标定量法，以标准品与内标 物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出8-羟 基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的含量，具体色谱条件为：

(1)高效液相色谱条件：

流动相A：0.1％v/v的甲酸水溶液；

流动相B：乙腈；

色谱柱为UltimatePolar-RP，2.1×100mm，3μm；

流速为0.4mL/min；

柱温为30℃；

进样量为10μL；

采用梯度洗脱方式，见表1；

表1液相梯度洗脱参数

(2)质谱条件：

在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾针电压 为5500V；碰撞气为5psi；气帘气为50psi；离子源雾化气和加热辅助气均为65psi；脱 溶剂气温度为550℃。

2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧 鸟苷和8-羟基鸟苷的方法，其特征在于，所述的标准品溶液按照如下方法制备得到：

分别准确称量5mg的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，于甲醇中溶解定容至10mL， 配制成浓度分别为0.48mg/mL和0.485mg/mL的储备液A和B，-20℃保存；取储备液A 和B各100μL混合后用甲醇稀释后定容至10mL，配制成8-羟基脱氧鸟苷浓度为 4.8μg/mL，8-羟基鸟苷浓度为4.85μg/mL的混合标准液C1，-20℃保存；取100μL混合 标准液C1用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，配制得到8-羟基脱氧鸟苷浓度为 96ng/mL，8-羟基鸟苷浓度为97ng/mL的混合标准液C2；取500μL混合标准液C2用空 白人工尿液基质稀释后定容至5mL，配制得到8-羟基脱氧鸟苷浓度为9.6ng/mL，8-羟基 鸟苷浓度为9.7ng/mL的混合标准液C3；

准确称量5mg的[¹³C，¹⁵N₂]-8-羟基脱氧鸟苷，用甲醇溶解定容至10mL后得到浓度 为49.55μg/mL的内标物储备液，内标物储备液经甲醇稀释至0.991μg/mL得到内标物工 作液D；内标物储备液和内标物工作液D均于-20℃下保存；

分别取25μl、50μL和100μL混合标准液C2用空白人工尿液基质稀释并定容至 100μL作为标准校准点S5、S6和S7；分别取5μL、10μL、50μL和100μL混合标准液 C3用空白人工尿液基质稀释并定容至100μL，得到标准校准点S1、S2、S3和S4；这7 个浓度点体积均为100μL；然后向各组标准校准点中加入15μL0.991μg/mL内标物工作 液D，混合均匀后用甲醇定容至0.5mL，然后涡旋20秒后振荡10min，于4℃下12000g 离心5min后取10μL上清液，即得标准品溶液；

其中，

S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7作为8-羟基脱氧鸟苷的校准点，S2、S3、S4、S5、 S6和S7作为8-羟基鸟苷的校准点。

3.根据权利要求2所述的高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧 鸟苷和8-羟基鸟苷的方法，其特征在于，所述的空白人工尿液基质由如下方法制备得到：

分别取0.5586g二水合氯化钙、0.6099g六水合氯化镁、4.2077g氯化钠、2.0596g 硫酸钠、0.6470g柠檬酸钠二水合物、0.0201g草酸钠、2.5449g磷酸二氢钾、1.4388g氯 化钾、0.9200g氯化铵、2.4985g尿素和1.0520g肌酐用水溶解并定容至1L。