[发明专利]一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法。属于兽用生物制品领域。

技术背景

牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea，BVD)是黄病毒科瘟病毒属牛病毒性腹泻病毒/黏膜病病毒(BovineviraldiarrheaVirus，BVDV)引起的以腹泻为主要症状的重要传染病，各年龄牛均易感。主要症状为：腹泻，急、慢性黏膜病，持续性感染与免疫耐受，母畜流产、死胎和畸形。除感染牛外，还可感染猪、羊、鹿、骆驼及其它野生动物。Olafson(1946)等首先在美国纽约以消化道溃疡和下痢为特征牛中发现牛病毒性腹泻(BVD)。Ransey和Chiver(1953)发现黏膜病(MD)。KMLe等(1957)首次分离到病毒。Gillespie和Barker(1959)分离出New-York株和Indiana株。Gillespie(1960)分离出OregonC24V株(标准毒株)。1971年由美国兽医学会统一命名为BVD-MDV。我国李友民等(1981)在吉林省首次从国外引进牛的流产胎儿脾脏中分离并鉴定出BVDV，证明该病在我国存在。目前，我国20多个省市自治区检出此病。本研究使用的制苗毒株BVDV/NMG株，是2010年从内蒙古某牛场疑似病例中采集血清样品，利用MDBK细胞培养分离出的一株BVDV。该分离株F2代即可在MDBK细胞上产生细胞圆缩、聚合、出现空洞，大部分细胞脱落等BVDV的典型CPE，为CP型BVDV。电镜和理化检测均符合BVDV特征，如为圆形，有囊膜直径约50nm左右病毒粒子，对5-碘脱氧尿核苷不敏感，对乙醚、酸均敏感，56℃作用70min可被完全灭活等。

牛传染性鼻气管炎(Infectiousbovinerhinotracheitis，IBR)俗称“红鼻病”或“坏死性鼻炎”，由牛疱疹病毒I型(BHV-1)牛传染性鼻气管炎病毒(Infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBRV)引起的一种急性、热性、接触性烈性传染病，OIE将其列为法定报告动物疫病。其自然宿主是牛。病毒感染牛体后，可潜伏于神经系统，使感染变得呈间歇性、持续性，而且病牛会长期或终身带毒。1995年本病最现发现于美国科罗拉多州的育肥牛。1956年Madin等首次从患牛分离出病毒。1964年Huck鉴定BHV-1属于疱疹病毒。1990年Edwards等将BHV-1分为2个型，其中BHV-1.1与IBR有关，BHV-1.2与(传染性脓疱性外阴阴道炎)有关。我国最早在20世纪70年代在进口牛群中发现，而1981年周泰冲等首次在深圳海关从新西兰进口奶牛中分离到病毒。1986年王则兴等从乳牛、水牛、黄牛中分离到此病毒，证明IBR在我国存在。经流行病学发现，目前我国绝大部分省、市、区均有IBR感染的牛群，但感染率高低不同，同时亦有病毒分离的报道。

发明内容

本发明的目的在于解决微载体悬浮培养MDBK细胞繁殖牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒以制备牛病毒性腹泻/黏膜病、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗。

本发明采用MDBK一种细胞繁殖牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒，进而将此两种病毒作为制苗用抗原并制备成预防牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎的二联灭活疫苗。。同时，本发明提供了一种牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒适应微载体悬浮培养细胞MDBK的方法。

本发明的技术方案

1.一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗含有灭活的牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV)NMG株和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)LY株。

2.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于该方法为：

(1)分别用BVDVNMG株病毒和IBRVLY株病毒作为生产种毒通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原；

(2)两种病毒抗原经灭活后按比例混合配制成水相；

(3)与油相混合乳化成二联灭活疫苗。

3.如权利要求1所述的一种牛病毒性腹泻/黏膜病-牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的生产方法，其特征在于其中BVDVNMG株病毒和牛传染性鼻气管炎病毒IBRVLY株病毒均用传代细胞MDBK繁殖的；