[发明专利]一株粘质沙雷氏菌及其应用

说明书

本发明提供一株粘质沙雷氏菌及其应用，属于生物工程领域。本发明提供了一株粘质沙雷氏菌，保藏编号为（CCTCC M 2015732）该菌以蔗糖为碳源促进产酶，经液体发酵可得到高产量的过氧化氢酶，酶活高达32752U/mLU/ml。本发明过氧化氢酶制剂制备简单、酶活性高，造价低廉，该酶制剂在纺织、造纸等领域有良好的应用前景。

技术领域

本发明提供一株粘质沙雷氏菌及其应用，属于生物工程领域。

背景技术

过氧化氢是一种强氧化剂，广泛应用与工业、食品和医疗领域的漂白和消毒，但是其残留对于严重影响生产工艺和身体健康。过氧化氢酶可以特异性的分解过氧化氢为无毒的水和氧气，是一种高效环保的过氧化氢去除途径。过氧化氢酶广泛存在于动植物和好氧微生物中，最初过氧化氢酶是从猪牛等动物肝脏中提取纯化的，但该方法受限于原料有限、成本高和工艺复杂，相比而言微生物发酵生产过氧化氢酶则有产量大、活性高、酶学性质丰富、成本低廉等诸多优点。目前国外已有相关微生物发酵过氧化氢酶商品，国内有一些文献及专利报道过氧化氢酶产酶菌株，多数菌株产酶能力在每毫升发酵液几百至几千个酶活力单位，仅江南大学陈坚教授（文献）和江南大学专利CN 101805709 B报道菌株酶产量达到2万个酶活左右。本发明人发现一株高产过氧化氢酶的菌株，且通过液体发酵得到过氧化氢酶酶液，该酶液可以高效分解过氧化氢。基于以上发现提出了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一株过氧化氢酶高产菌株，和以大豆蛋白胨为氮源，蔗糖为碳源发酵生产过氧化氢酶的工艺。所产过氧化氢酶制剂活性高，生产成本低廉，适于纺织、造纸等生产工艺中残留过氧化氢的去除。

所述粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens） KAT-1，该菌株已于2015年12月9日保存在中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015732。

本发明的技术方案：

1、菌株的筛选及鉴定

（1）筛选：挑去从土壤中分离纯化的细菌纯培养于液体种子培养基中震荡培养，取100微升发酵液加入100微升过氧化氢，有大量气泡产生的菌株为产酶菌株。

（2）鉴定：对该菌株16S rRNA进行PCR扩增与测序，NCBI数据库比对显示该菌为粘质沙雷氏菌。

（3）菌株特征：菌落为圆形突起，乳白色；及发酵液为淡黄色，不产红色灵菌素。光镜下菌体为圆形。

（4）过氧化氢酶活性测性方法：发酵液超声破碎直至澄清，用pH7.0的PBS缓冲液稀释适当倍数后备用。过氧化氢酶酶活测定方法：3.9ml反应液（02M PBS pH7.0,20mM H₂O₂)迅速加入0.1ml酶液中, 在240nm波长下测定吸光度的变化，每隔5s计数一次。H₂O₂的摩尔消光系数为43.6。过氧化氢酶酶活的定义为酶分钟消耗1微摩尔H₂O₂所用的酶量为1U。

2、应用菌株Kat-1发酵生产过氧化氢酶。工艺如下：

（1）种子液制备：

种子培养基为：大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏2g/L，NaCl1g/L，pH为7.0.

种子液制备方法：挑取一环菌株Kat-1的纯培养于50ml种子培养基中，180r/min培养12h即为种子液。

（2）发酵产酶：

产酶培养基：大豆蛋白胨10~40g/L，牛肉膏2g/L，NaCl 1g/L，蔗糖30~90g/L，pH为7.0。

发酵产酶：以2%接种量接种液体摇瓶培养基。发酵温度为30~35℃，转速为180~220r/min，。