[发明专利]东方巴贝斯虫凝血酶素基因1及其编码的蛋白

说明书

本发明公开了一种东方巴贝斯虫凝血酶素基因1，该基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明还公开了编码所述东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的重组蛋白，该重组蛋白具有如序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该重组蛋白可有效检测感染东方巴贝斯虫的水牛的抗原的存在，具有良好的反应原性，是开发检测东方巴贝斯虫病血清学诊断方法的候选因子，有助于控制水牛的巴贝斯虫病在我国的流行和传播。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一个新基因及其重组蛋白，具体是指东方巴贝斯虫凝血酶素基因1及其编码的重组蛋白，本发明还涉及重组蛋白的应用。

背景技术

水牛巴贝斯虫病(Babesiosis)是由东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)寄生于水牛的红细胞引起的以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿为临床特征的蜱传性血液原虫病。该病在我过南方的湖北、福建、江西、安徽、江苏、浙江、湖南、广西、云南、贵州等省份广泛流行，对水牛养殖业和农业生产造成严重影响。东方巴贝斯虫自1984年首次报道以来，其传播和流行呈扩散趋势，分析其原因主要有以下三点：首先，动物一旦感染巴贝斯虫，便终生带虫，虫体在动物体内长期存在，一旦动物抵抗力低下或应激情况下即表现严重的临床症状；其次，东方巴贝斯虫的传播媒介镰形扇头蜱是三宿主蜱，一年发生一代，该蜱可经卵传播东方巴贝斯虫，据文献报道，阳性蜱可传播东方巴贝斯虫30代以上；第三，由于近年来交通运输越来越发达，在一定程度上增加了东方巴贝斯虫病的传播和流行；第四，随着近年来肉牛养殖业的发展，大量非流行区的牛进入东方巴贝斯虫流行区育肥，而这些牛几乎100％发病。

综合以上可看出，一旦某区域成为疫区，东方巴贝斯虫病便难以根治和清除，因此要控制该病的传播和流行，诊断和疫苗尤为重要。到目前为止，东方巴贝斯虫病的检测没有诊断试剂盒。因而筛选、鉴定具有良好免疫原性和反应原性的东方巴贝斯虫抗原便是解决途径之一。

发明内容

本发明的第一个目的是从东方巴贝斯虫中获得凝血酶素基因1。

本发明的第二个目的是将所述东方巴贝斯虫凝血酶素基因1在大肠杆菌表达系统中高效表达获得重组蛋白。

本发明的第三个目的是提供上述重组蛋白在制备东方巴贝斯虫病的检测试剂盒中的应用。

(1)本发明所述东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的获得：利用聚合酶链式反应(PCR)的方法，以东方巴贝斯虫总RNA为模板，反转录成cDNA，经PCR得到东方巴贝斯虫凝血酶素基因1，其核苷酸序列的开放阅读框(ORF)如序列表SEQ ID NO：1所示。

(2)编码了所述东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的重组蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

(3)所述重组蛋白，其制备方法为：将序列表SEQ ID NO：1所示的东方巴贝斯虫凝血酶素基因1开放阅读框(ORF)与大肠杆菌表达载体构建重组表达质粒pE-SUMO-TRAP1，电转化至BL21中，抗生素氨苄青霉素筛选高抗性的转化子，并用0.8mmol/L IPTG于37℃诱导4h。收集上述IPTG诱导表达的菌液，对其进行分离纯化的蛋白即为编码了东方巴贝斯虫凝血酶素基因1的重组蛋白。

(4)重组蛋白纯化处理，按上述方法诱导表达1000ml菌液，将表达的菌液转移到离心管于4℃条件下8000r/min离心10min集菌。取30mLHis-binding buffer(PH7.8)重悬菌体沉淀后，使用压力破碎仪破碎(3次)；4℃，10000r/min离心5min，弃沉淀，收集上清，微滤后，用镍亲和层析柱(GE)纯化，纯化步骤同说明书。

(5)Western blot方法检测重组表达蛋白的反应原性——将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上，分别以东方巴贝斯虫水牛阳性血清和健康水牛血清做一抗、HRP标记的兔抗牛IgG为二抗进行Western blot分析。