[发明专利]一种发酵液中乳酸链球菌素效价的检测方法在审

专利信息
申请号: 201610008223.1 申请日: 2016-01-05
公开(公告)号: CN105466873A 公开(公告)日: 2016-04-06
发明(设计)人: 张拴力;扈士海;赵地顺;张桂彦;王素新 申请(专利权)人: 石家庄新宇三阳实业有限公司
主分类号: G01N21/31 分类号: G01N21/31
代理公司: 石家庄新世纪专利商标事务所有限公司 13100 代理人: 侯迎新
地址: 051430 *** 国省代码: 河北;13
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摘要:
搜索关键词: 一种 发酵 乳酸 链球 菌素 检测 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及发酵液中乳酸链球菌素的检测,尤其是涉及一种快速批量化检测乳酸链球菌素效价方法的改进。

背景技术

乳链菌肽(乳酸链球菌素,简称Nisin)是从乳酸乳球菌的代谢产物中提取得到的一种多肽物质,由34个氨基酸组成,能显著抑制革兰氏阳性菌的增长,可用于乳和乳制品、肉和肉制品的防腐保鲜,是一种公认的安全无毒的天然生物性食品防腐剂和抗菌剂,广泛应用于食品工业,目前已有60多个国家批注允许使用。

Nisin定量分析的最初测定的方法为1934年CoxGA等人建议采用的甲基蓝还原法,后来相继开发了用于Nisin定量的生物分析法,包括试管稀释法(TubeDilution)、浊度分析法(TurbidityAssays)、琼脂扩散法(AgarDiffusionTest)、ATP生物发光测定法(ATPBioluminometry)、绿色荧光蛋白测定法(GFPbioassay)、微量滴定法(Microtitration)、HPLC等。

Nisin定量的生物分析法中最普遍是琼脂扩散法(ADT),尤其适用于那些高度不透明的、不能用浊度分析法分析的样品。WolfandGibbons(1996)改进了琼脂扩散法,提高了灵敏度、准确性。其原理是在琼脂表面利用检测菌的生长显示抑菌效果,为消除干扰因素的影响,常使用Nisin标准液和未知样液在同一平板扩散,并由他们的抑菌圈直径及标准效价换算出效价。由于Nisin的扩散性能差,故常在检测培养基做加入1%Tween以促进Nisin在琼脂中扩散。但是人们又普遍地认为它的影响因素太多,操作繁琐,而且准确性、重复性也不是很理想。

生物分析的重要性不可否认,但费时,受低特效性、低灵敏度和源于食品提取液和发酵液相互干扰等因素的制约,借助于免疫方法的迅速、直接和灵敏的技术,现已开发出定量检测Nisin的免疫技术。免疫学方法具有高灵敏性,但是却并不具有高特异性,而且现阶段抗体制备困难、成本高,这些都限制了它的应用,不过随着抗体工程的发展,生产实用、廉价的检测试剂盒也不失为一个好的发展方向。

现有的检测方法很多,但是都有各自的优缺点。为了适应研究和生产的迫切需要,Nisin的快速检测方法研究很有必要。在过去,人们也应用了许多其它的新方法来检测Nisin的含量,如辐射线法、电导率测定法、自动化浊度法,基质辅助激光解吸/离子化质谱法、毛细管区带电泳法、血细胞计数法等HPLC法。因为需要专用的仪器和设备,没有被广泛接受。

我们选择一种指示菌,通过测定不同Nisin浓度下指示菌的生长情况,做出标准曲线,同时对发酵液也加入指示菌测定指示菌在发酵液中的生长情况,从而判定发酵液中Nisin的效价,该方法可以一次做多个样品,具有一定的优势。

在使用分光光度法检测指示菌生长情况的过程中,发现按中国工业微生物菌种保藏管理中心的说明中给出的培养基对藤黄微球菌进行培养,30℃下需要1-2天,生长缓慢,导致实验周期长、实验结果准确度差。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种改进的发酵液中乳酸链球菌素效价的检测方法,其不仅要节省时间,提高准确度,还要降低成本。

为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是:一种发酵液中乳酸链球菌素效价的检测方法,其特征在于:采用分光光度法,具体方法为:

选用一种指示菌,通过测定在含有一定浓度的乳酸链球菌素的培养基中指示菌生长的OD值来制做标准曲线,然后测定含有一定量的待测发酵液的培养基中指示菌生长的OD值,对比确定发酵液中乳酸链球菌素的浓度;

所述指示菌选用藤黄微球菌;

对上述藤黄微球菌的培养基进行优化,优化的方法为:优化培养基添加了葡萄糖、K2HPO4、MgSO4·7H2O。

优化培养基的最佳组合为添加葡萄糖0.5%、K2HPO40.2%,MgSO4·7H2O0.03%。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于:

1、本发明通过设计对藤黄微球菌的培养基进行了系统优化,并在此基础上,建立一种可快速检测Nisin效价的改进的分光光度法,这样不仅节省了时间,提高了准确度,还降低了成本。本发明在检测中对培养基配方进行优化,在基础培养基基础上添加了一些营养成分,保证指示菌的生长,进而满足大量样品快速检测的要求。

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