[发明专利]一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-T转基因载体，其特征在于，包括：用于质粒复制的原核复制子pUCOri序列，如SEQIDNO.2所示；用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQIDNO.1所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40Ori序列，如SEQIDNO.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；用于真核细胞表达绿色荧光的ZsGreen1绿色荧光蛋白，如SEQIDNO.11所示；用于共同转录表达蛋白质的IRES核糖体结合序列，如SEQIDNO.12所示；用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人EF1α启动子，如SEQIDNO.14所示；用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受体；用于增强转基因的表达效率的eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQIDNO.13所示。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述用于组成集识别、传递、启动于一体的二代CAR的嵌合抗原受体包括：如SEQIDNO.15所示的CD8leader嵌合受体信号肽、如SEQIDNO.20所示的CD19VL、如SEQIDNO.19所示的OptimalLinkerC、如SEQIDNO.16所示的CD19单链抗体重链VH、如SEQIDNO.21所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、如SEQIDNO.22所示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、CD28、如SEQIDNO.23所示的CD137嵌合受体共刺激因子、如SEQIDNO.24所示的TCR嵌合受体T细胞激活域。

3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述用于组成集识别、传递、启动于一体的三代CAR的嵌合抗原受体包括：如SEQIDNO.15所示的CD8leader嵌合受体信号肽、如SEQIDNO.20所示的CD19VL、如SEQIDNO.19所示的OptimalLinkerC、如SEQIDNO.16所示的CD19单链抗体重链VH、如SEQIDNO.21所示的CD8Hinge嵌合受体铰链、如SEQIDNO.22所示的CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、CD28、如SEQIDNO.23所示的CD137嵌合受体共刺激因子、如SEQIDNO.24所示的TCR嵌合受体T细胞激活域、以及如SEQIDNO.25所示的CD28嵌合受体共刺激因子。

4.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述慢病毒包装顺式元件采用第二代慢病毒载体包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、如SEQIDNO.8所示的RRE顺式元件、如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式元件。

5.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体包括：如SEQIDNO.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDNO.6所示的慢病毒3terminalSelf-InactivatingLTR、如SEQIDNO.7所示的Gag顺式元件、如SEQIDNO.8所示的RRE顺式元件、如SEQIDNO.9所示的env顺式元件、如SEQIDNO.10所示的cPPT顺式元件，以及如SEQIDNO.4所示的RSV启动子。

6.如权利要求1-5任一项所述的载体，其特征在于，所述eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件有6个核苷酸的增强突变，具体为：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。