[发明专利]基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法

权利要求书

1.一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将烟酰胺核苷激酶基因，连接到载体上，构建表达载体；

2）将步骤1）的表达载体通过低能离子束介导技术导入大肠杆菌；所述低能离子束介导的能量为14~18KeV，剂量为（80~200）×10¹⁴ions/cm²，靶室真空度为（1.0~2.0）×10^-3Pa；所述离子为氮离子；

3）利用选择性培养基进行重复筛选，获得可以表达烟酰胺核苷激酶的重组大肠杆菌；

4）将重组大肠杆菌接种到发酵培养基中发酵生产辅酶I。

2.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，步骤1）所述烟酰胺核苷激酶基因为罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii） ARSEF 23的NRK基因片段MAA_05394，所述载体为pet28a。

3.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，步骤3）选择性培养基是在LB培养基中加入50ug/ml的卡那霉素。

4.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，步骤4）中发酵培养基包含按质量百分比的如下组分：碳源2-6%、氮源 0.5-1%，无机盐0.01-0.1%，生长因子0.1-0.4%，余量为水，pH=7.0-7.2，其中碳源为葡萄糖、蔗糖和甘油中的至少一种；氮源为酵母膏、玉米浆、蛋白胨和氯化铵中的至少一种；无机盐为氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠中的至少一种；生长因子为腺嘌呤或烟酰胺中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，步骤4）接种量为1-5%(V/V)，发酵培养的温度为28-34℃，摇床转速为200-250r/min。

6.根据权利要求5所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，步骤4）中接种后检测OD在0.6-0.8时加入终浓度为0.5mM IPTG诱导培养12-16h，然后加入终浓度为0.2-0.5%表面活性剂，继续培养4-8h，其中表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠、十四烷基苯磺酸钠和十六烷基苯磺酸钠中的一种。

7.根据权利要求1所述的一种基于离子束介导技术构建重组大肠杆菌生产辅酶I的方法，其特征在于，步骤2）中离子束介导的能量为18KeV，剂量170×10¹⁴ions/cm²，靶室真空度为1.6×10^-3Pa。