[发明专利]新型节杆菌启动子序列及其应用

说明书

本发明通过鸟枪法筛选得到了新型节杆菌启动子的基因序列，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示，SEQ ID NO：2～4所示的核苷酸序列是通过将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列逐渐缩短得到的。将得到的强度最强的启动子构建到表达质粒上，在节杆菌中过表达cAMP生产关键酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT，得到的重组菌的cAMP的产量达到了7.57g/L。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及节杆菌启动子序列及其应用。

背景技术

启动子是一段位于结构基因5’端上游的DNA序列，RNA聚合酶能够与之结合并起始基因的转录^[1]，这是基因表达的最关键阶段。原核生物一个基因的转录单元是从启动子开始至终止子结束，RNA聚合酶从转录起始位点开始沿着模板前进，直到终止子为止，转录出一条完整的mRNA链。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响基因的表达水平。由此可见，启动子决定了基因的表达程度和表达时间，是基因表达最重要的调控元件之一。近些年，随着合成生物学的发展，筛选多样性的启动子也越来越受到人们的重视。

节杆菌是一种在土壤中分布广泛的专性好氧微生物，在系统分类学上属于放线菌微球菌科(Micrococcaceae)。节杆菌细胞在生长过程中会产生显著的形态变化，早期培养物中的细胞呈不规则细杆状，部分杆菌按照一定的角度排列，进入稳定期后细胞呈球形，将其转接到新鲜的培养基中，细胞又会产生分支，形成不规则的杆状，如此循环是节杆菌最典型的形态特征。节杆菌既可以生存在普通的土壤中，也可以生存在各种条件复杂的极端环境中，如有机溶剂、极寒地区等，近些年的研究表明节杆菌除了具有以上抗逆性以外还能用于生产氨基酸和生物表面活性剂。因此，对节杆菌的相关研究具有重要的工业应用价值。

但是，目前节杆菌可用的表达质粒很少，从而限制了节杆菌的基因研究和工业应用。已经报道的节杆菌质粒主要有如下几个：1988年Shaw等利用来源于谷氨酸棒杆菌的复制原点pBL100，以pULRS8为骨架构建了一种隐蔽质粒。2005年Sandu等利用来源于谷氨酸棒杆菌的复制原点pCG100构建了pART2和pART3两种质粒。其中pART2可以用于基因的组成型表达，pART3可以用尼古丁诱导基因表达。以上所报道大肠杆菌-节杆菌穿梭质粒都是利用系统发育相近物种的隐蔽质粒构建的。2008年Miteva等报道了以节杆菌隐蔽质粒p54为骨架的杂交载体(hybrid vector)pSVJ21。2011年Ruta等报道了以Arthrobacter rhombi隐蔽质粒pPRH为复制子来源的E.coli-Arthrobacter穿梭质粒Prmu824Km。上述几种质粒，只有pART2和pART3可以用于在节杆菌中表达基因，其他的质粒仅限于用于研究质粒在节杆菌中的拷贝数及节杆菌的电转化实验。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种高效的节杆菌新型启动子。

本发明还要解决的技术问题是，提供一种节杆菌启动子的筛选方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述节杆菌启动子的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种节杆菌启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。

SEQ ID NO：2～4所示的核苷酸序列是在SEQ ID NO：1的基础上逐渐缩短得到的。

节杆菌启动子序列的筛选方法，包括如下步骤：

(1)提取节杆菌基因组DNA；

(2)Sau3AⅠ酶切节杆菌基因组DNA，回收100～1000bp之间的片段；