[发明专利]一种Plipastatin衍生环五脂肽及其产生菌和应用

说明书

本发明公开了一种Plipastatin衍生环五脂肽及其产生菌和应用。产Plipastatin衍生环五脂肽的枯草芽孢杆菌Best2，通过同源重组的方法靶向缺失枯草芽孢杆菌pB2‑L基因组中的ppsC和ppsD基因，获得缺失ppsC和ppsD基因的枯草芽孢杆菌Best2。在改良的Landy培养基中对枯草芽孢杆菌Best2进行发酵，获得含Plipastatin衍生环五脂肽的发酵液，对发酵液进行分离纯化，获得含Plipastatin衍生环五脂肽粗提物。该新型的plipastatin衍生环五脂肽不仅对丝状真菌仍然具有一定的抑菌活性，并且对革兰氏阳性菌的抑菌活性有所提高。

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程领域，涉及一种Plipastatin衍生环五脂肽及其产生菌和应用。

背景技术

很多微生物产生的次级代谢产物中含有一类分子量较小、成环的短肽骨架和β-羟基脂肪酸链尾构成的脂肽抗菌物质，除了具有良好的表面活性和抗菌活性，还具有抗肿瘤、抗病毒、抗感染等生物功效以及其他药理活性；另外脂肽及其衍生物结构多种多样，因而极大地拓宽和丰富了药物筛选来源的天然化合物库，在创制新型有效药物方面具有潜在的价值。

Plipastatin是导入了有功能活性的sfp基因的Bacillus subtilis 168菌株产生的一种与 Fengycin结构和性质非常类似的物质，也归于Fengycin家族；是由14～18个碳原子组成的β- 羟基脂肪酸和成环十肽两部分组成，微生物发酵产生的Plipastatin是多种同系物组成的混合物； Plipastatin对丝状真菌显示了良好的抑菌活性，而对酵母和细菌没有作用。

Plipastatin是由Plipastatin合成酶通过“多载体巯基化模板机制”合成的一类非核糖体肽；枯草芽孢杆菌Plipastatin合成酶基因簇包含5个ORF，分别编码Plipastatin合成酶的五个酶亚基，在基因簇中呈线性排列，分别是ppsA、ppsB、ppsC、ppsD和ppsE；随着组合生物学的发展，本发明将在基因层面将Plipastatin合成酶系进行重新组合，构建杂合的Plipastatin合成酶，利用该杂合酶系产生天然活性物质，在完善微生物药物创制等方面提供了不同于化学合成的全新思路和策略。

发明内容

本发明的目的是提供一种产Plipastatin衍生环五脂肽的枯草芽孢杆菌Best2。

本发明的另一目的是提供制备Plipastatin衍生环五脂肽的方法及获得的Plipastatin衍生环五脂肽。

本发明的又一目的是提供Plipastatin衍生环五脂肽的应用。

一种产Plipastatin衍生环五脂肽的枯草芽孢杆菌Best2，通过同源重组的方法靶向缺失保藏号为CGMCC No.11723的枯草芽孢杆菌pB2-L基因组中的ppsC和ppsD基因，获得缺失ppsC 和ppsD基因产Plipastatin衍生环五脂肽的枯草芽孢杆菌Best2。

所述的枯草芽孢杆菌Best2，优选通过以下方法构建：

(1)构建缺失ppsC和ppsD基因的敲除质粒pKS-CD：

a.根据NCBI数据库设计如下引物：

P1：SEQ ID NO.1，P2：SEQ ID NO.2，P3：SEQ ID NO.3，P4：SEQ ID NO.4；

b.以B.subtilis pB2-L基因组为模板，用引物P1、P2和引物P3、P4分别扩增上下游片段，再以上、下游片段为模板，在反应体系中加入P1、P4进行融合PCR反应，获得敲除基因片段 CD；

c.用限制性内切酶对敲除基因片段CD和质粒pKS2进行酶切，并通过连接反应将敲除基因片段插入质粒pKS2获得pKS-CD；