[发明专利]一种利用高效液相鉴别低分子肝素中寡糖的分析方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种利用高效液相鉴别低分子肝素中寡 糖的分析方法。

背景技术

肝素是一种酸性黏多糖，由Mclean首先发现其抗凝作用，Brinkous等证明了其抗 凝血活性，自20世纪30年代开始用于临床，经过70多年的临床研究，人们已对肝素的抗凝作 用机理有了深刻的认识。随着对肝素的深入研究，特别是对以往认为无活性的低分子组分 对Ⅹa因子和Ⅱa因子（凝血酶）的作用差异的认识，为开发低分子肝素提供了理论依据，20 世纪70年代末，低分子肝素进入临床。

低分子肝素（Lowmolecularweightheparin,LMWH）是由普通肝素经物理、化学 或酶解聚方法而得，分子量范围为3000～8000，具有较肝素更优的抗血栓活性，且与肝素相 比，出血副作用少、生物利用度高、半衰期长、抗凝效果可以预测且无需实验室监测，目前临 床适应症不断扩大。历经几十年的发展，LMWH的研究已取得较大的进展。本发明将就LMWH的 结构与生物活性、生产制备技术、制剂的研发及质量标准研发。

LMWH自19世纪70年代进入临床以来，发展迅猛，已经占据抗凝药物市场的大部分 份额，尤其在心脑血管疾病的应用中发挥巨大的作用。肝素是其最主要的制备来源，而肝素 主要是从猪或牛等哺乳动物的器官和组织中提取而来，保证肝素质量至关重要。由于生物 来源的原材料的局限性，有关学者已采用生物体内或人工合成肝素的方法，人工合成肝素 分化学法、酶法及化学酶法合成等。由于天然多糖结构的复杂性，化学法合成较复杂且合成 率低。随着基因工程方法克隆表达相应的酶以提高酶产量等生物工程方法的发展，酶法合 成肝素及肝素类似物成为一种较好的来源途径。所以肝素的来源也是值得探究的领域。日 本有人发现一种来源于海参中的糖胺聚糖的解聚产物（DHG），不仅表现出与肝素类似的抗 凝血活性，且剂量在一定范围内时，动物实验引起的出血副作用低于LMWH和普通肝素；巴西 和美国研究员从虾中分离得到一种LMWH[24]，该来源的LMWH的抗凝血活性大于哺乳类动物 来源的LMWH。这些研究也启发我们从哺乳动物来源外的其他来源中获取LMWH。因此，关于 LMWH的研究，进一步确定其精细结构、寻找新来源及研制新剂型应用于临床等方面均是研 究的热点和难点，需要各国、各界学者的不懈努力共同为LMWH的进一步开发利用贡献力量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用高效液相鉴别低分子肝素中寡糖的分析方法，旨 在解决目前监测方法不能简单、快速、准确地检测低分子肝素的双糖结构，不能对低分子肝 素的结构稳定提供数据支持，从而不能实现低分子肝素质量稳定的问题。

本发明是这样实现的，一种利用高效液相鉴别低分子肝素中寡糖的分析方法，该 方法包括：

步骤一，样品液的配置：称取低分子肝素钠样品，精确称量，精确至0.0001g，

用纯化水溶解后，定容至刻度线；

步骤二，涂渍液的配置：准确称取十六烷基三甲基硫酸氢铵，用H2O/CH3OH的甲醇在容 量瓶中定容，使用之前超声脱气；

步骤三，流动相A的配置：用甲磺酸调节pH值5.0的纯化水，用0.22μm

滤膜过滤，使用之前超声脱气；

步骤四，流动相B的配置：称取甲磺酸氨，用纯化水溶解，将配好的溶液转入容量瓶中， 用纯化水定容至刻度线，pH值为5.0，用0.22μm滤膜过滤，使用之前超声脱气；

步骤五，称取HS与FITC，溶于碳酸钠缓冲液中，避光、震摇反应。

进一步，所述步骤二中H2O/CH3OH的体积比为H2O/CH3OH=60：40。

本发明克服了低分子肝素钠生产过程中结构不稳定的难题，大大降低低分子肝素 钠成品的不合格风险和企业生产成本；

本发明通过低分子肝素中硫酸根离子与C18树脂柱中季铵盐离子的结合能力，利用紫 外检测器与荧光检测器将低分子中的寡糖标记、分析。实现了对低分子肝素结构的组分确 定。本发明有效分析产品结构，检测灵敏度高、重现性好，整个检测方法简单、快速，便于工 业化推广应用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的利用高效液相鉴别低分子肝素中寡糖的分析方法流程 图；

图2是本发明实施例提供的利用高效液相鉴别低分子肝素中寡糖的分析方法实施例一 中原研样品检测液色谱图；